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全脑缺血再灌注大鼠小脑NGF、BDNF的表达
中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：李爱丽 关文明 王彦红 石育原
单位：李爱丽（白求恩医科大学二院神经科，长春130041）；关文明（白求恩医科大学二院神经科，长春130041）；王彦红（长春市中医院神经内科,长春 130021）；石育原（白求恩医科大学基础部，长春 130021）
关键词：老龄大鼠；缺血再灌注；神经生长因子；脑源性神经营养因子
摘 要 目的：探讨老龄大鼠全脑缺血再灌注损伤对小脑NGF、BDNF 表达的 影响。方法：采用Pulsinelli-Brierley4血管阻塞法进行改良制作全 脑缺血再灌注 动物模型，通过免疫组化方法对小脑NGF、BDNF的表达进行动态观察。结果：缺血 再灌注损伤时，小脑分子层、颗粒层和髓质出现一过性NGF表达，而梨状细胞层NGF表达呈持 续性；小脑分子层和梨状细胞层始终无BDNF表达，颗粒层的BDNF表达量无变化，但 髓质BDNF表达量出现增加现象。结论：小脑对缺血再灌注损伤具有短 暂的 NGF保护作用，分子层和梨状细胞层不存在BDNF保护机制，而髓质具有良好的BDNF保护机制 。
中国图书分类号 R743.3
Expressions of NGF and BDNF in cerebellum area s after whole brain ischemia/reperfusion in senile Wistar rats
LI Ai-Li GUAN Wen-Ming WANG Yan-Hong
（Dept. of Neurology, Sec ond Teaching Hospital Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130041）
Abstract Objective:To explore the effects of NGF a nd BDNF on cerebellum after ischemia/reperfusion in senile Wistar rats.Methods:The animal model of whole brain ischemia/reperfusion was m a de with improved method of bloching four-vessel of Pulsinelli-Brierley's.The d yn amic changes of expressions of NGF and BDNF in cerebellum were observed with imm unocytochemistry method.Results:There appeared a transient NGF expression in molecular, granular layers and medulla area ischemia reperfusi on h ppened, but persistent expression in Purkinje layer. There were no BDNF expressi ons in molecular and Prukinje layers, no expression change in granular layer, bu t rich expression in medulla after ischemia/reperfusion.The peak level of BDNF w a s observed in medulla of cerebellum.Conclusion:There was a transient protective action of NGF in cerebellum to ischemia/reperfusion, no pr otective action of BDNF in molecular and Purkinje layers,but well protectire act ion in medulla.
Key words Senile rat Ischemia/reperfusion NGF BDNF
神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)是近年来引起科学家们非常关 注的特异蛋白质分子［1］，NTFs有许多种类，神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是其中的2种。本文选 用Wistar老龄大鼠制作全脑缺血再灌注动物模型，采用免疫组化方法对缺血 小脑不同结构NGF、BDNF的表达进行动态观察，以揭示全脑缺血再灌注损伤后小脑 NGF、BDNF的神经生化改变。
1 材料与方法
1.1 动物分组及动物模型制备 选用Wistar老龄大鼠，月龄10～12个月，体重420～520 g，雌雄随机分组。假手术 组4只；实验组分脑缺血15 min组、脑缺血15 min再灌注1 h、6 h、2 d、4 d、9 d组，每 组5只。采用Pulsinelli-Brierley4血管阻塞法进行改良［2］，用10%水合氯醛给大鼠进行腹腔麻醉(0.3 ml/100 g体重)，分离双侧颈总动脉，用两根缝合线分别绕过每侧颈总动 脉系一个松套(待24 h后拉套断流用)，电凝双侧椎动脉。24 h后，在大鼠清醒状态下 拉双侧颈总动脉套，阻断双侧颈总动脉血流15 min，此为全脑缺血期，去除颈 总动脉套为再灌注期。假手术组不做颈总动脉断流和椎动脉电凝，其余过程与实 验组相同。
1.2 脑组织制备 各组大鼠在完成实验过程后给予10%水合氯醛过量腹腔麻 醉，然后用4%多聚甲醛 固定脑组织，取脑分离出小脑，将脑组织浸于相同固定液48 h，石蜡包埋。免疫组 化染色采用ABC法，试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。
1.3 表达结果判定方法 根据阳性细胞在相应视野内占的比例情况，将表达结果分成5种。(1)几乎无表 达：几乎无阳性细胞；(2)少量表达：阳性细胞占1/4；(3)中量表达：阳性细胞占 1/2；(4)大量表达：阳性细胞占3/4；(5)超大量表达：几乎均为阳性细胞。
2 结果
2.1 NGF表达 假手术组结果显示除梨状细胞层有少量NGF表达外，分子层、颗粒层和髓质均无 NGF表达。从缺血15min至再灌注2d期间，分子层、颗粒层和髓质均未出现NGF表达 ；到再灌4d时三者分别出现少量、中量和大量NGF表达；于再灌9d时，髓质NGF表达 变为少量，分子层和颗粒层NGF表达则消失。梨状细胞层于再灌注2d时NGF表达一过性 增加，此后降至基础水平，详见表1。
2.2 BDNF表达 假手术组结果显示分子层和梨状细胞层均无BDNF表达，颗粒层有少量BDNF表达， 而髓质有大量BDNF表达。从缺血15min至再灌9d期间，分子层和梨状细胞层始终无 BDNF表达；颗粒层BDNF的表达一直稳定保持原基础水平。髓质于缺血15min起BDNF 表达迅速增至超大量，再灌2d后降至原基础水平。具体表达结果见表1。
表1 老龄大鼠全脑缺血再灌注小脑NGF、BDNF表达结果
Tab.1 Expressions of NGF and BDNF in cerebellum areas
after whole brain ische mia/reperfusion in senile Wistar rats
| Groups | (Molecular layer)/(NGF BDNF) | (Prukinje layer)/(NGF BDNF) | (Granular layer)/(NGF BNDF) | (Medulla)/(NGF BDNF) |
| Gontrol group[ ]- - | + - | - + | - + | - +++ |
| Ischmia 15min | - - | + - | - + | - ++++ |
| Reperfusion 1h | - - | + - | - + | - ++++ |
| Reperfusion 6h | - - | + - | - + | - ++++ |
| Reperfusion 2d | - - | ++ - | - + | - +++ |
| Reperfusion 4d | + - | + - | ++ + | +++ +++ |
| Reperfusion 9d | - - | + - | - + | + +++ |
note:No expression,(+)A 1:ttle expression,(++) Middle quantity expression ,(+++) A great quantity expression,(++++) Super quantity expression3 讨论
正常老龄大鼠的小脑仅梨状细胞层有少量NGF表达，而分子层、颗粒层和髓质均无 NGF表达，这说明小脑不是富含NGF的脑组织。国内尚未见NTFS实验研究的报道，国外 关于NGF在小脑具体、详尽分布情况的研究尚少报道，仅见笼统报道小脑含有NGF。 在缺血15 min至再灌注2 d期间，分子层、颗粒层和髓质均未出现NGF表达，这说明上 述结构对急性应激刺激反应迟钝，或者提示参与神经细胞分泌NGF的调控系统对缺 氧不敏感；再灌4 d时的结果表明在慢性缺血再灌损伤情况下，分子层、颗粒层和髓 质具有短暂的NGF保护机制，即慢性应激刺激对NGF的调控系统有一定影响。4 d缺血 再灌损伤对大鼠来讲属于慢性应激刺激。梨状细胞层NGF的表达受缺血再灌损伤影 响很小，仅再灌2 d出现一过性增加，随即维持在基础水平，这表明梨状细胞层NGF 的表达对缺血再灌损伤也不敏感，并具有很强的耐受性和自我保护作用。梨状细胞 是小脑皮质的核心细胞，它接受所有传入小脑的信息，其轴突穿过颗粒层进入髓质 ，构成皮质唯一的传出纤维，故梨状细胞是体现小脑功能十分重要的细胞［3］。梨 状细胞层NGF的表达特点对于在缺血再灌损伤情况下保证小脑功能正常化具有很大的积 极意义。
正常老龄大鼠的小脑分子层和梨状细胞层均无BDNF表达，颗粒层有少量BDNF表达 ，髓质则有大量BDNF表达。我们曾检测过额叶、颞叶、顶叶、海马、丘脑、尾状核 、杏仁核BDNF的表达，与这些区域相比，以小脑髓质BDNF含量最高，此结果与国外某研究认 为BDNF含量以海马最高的结果不同［4］ 。另外，本研究结合我们曾做过的其它脑区BDNF的表达量来看，BDNF是最广泛分布 于脑组织中的NTFs，其含量也远高于NGF，这与国外研究结果一致［5］。在缺血再灌 损伤情况下，颗粒层BDNF的表达量一直没有变化，这表明颗粒层BDNF的表达对缺血再 灌损伤不敏感，并具有一定耐受性；在相同情况下，缺血再灌早期髓质BDNF的表达 有一过性增加，这对于缺血急性期减轻神经元损伤十分有益。在缺血损伤慢性期 ，髓质BDNF的表达量保持在基础水平，这表明髓质BDNF的调控系统对缺血有很强的 耐受性，这对于缺血慢性期保持髓质正常的神经功能具有积极意义。
缺血再灌损伤性刺激使小脑不同结构NGF、BDNF的表达产生不同变化，是哪些因 素致使这些结构NGF、BDNF的调控系统产生了不同的效应，有待今后进一步探讨。
本课题为吉林省卫生厅科研项目(94070)
作者简介：李爱丽，女，42岁，副教授，主要从事神经内科临床研究
4 参考文献
1，Phillips H S,Hains J M,Armanini M et al. BDNF mRNA is decreased i n the hippocampus of individuals with Alzheimer's disease. Neuron，1991；7：695
2，Pulsinelli W A, Brierley J B, A new model of bilateral himisphere Is chemia i n the unanes-thetized rat, Storch,1979；10：267
3，上海第二医学院主编.组织胚胎学.北京：人民卫生出版社，1978；91-96
4，Hofer M, Pagliusi S R, Hohn A et al. Regional distribution of brain-deri ved neurotrophic factor mRNA in the adult mouse brain. EMBO，1990；9：2459
5，Zafra F, Castren E, Thoenen H et al. Interplay betwween glutamate and gam -ma-aminobu-tyric acid transmitter systems in the physiological regulation of B DNF and NGF synthesis in hippocampal neurons. Proc Nati Sci USA, 1991；88：10037
［收稿1999-08-25 修回1999-10-15］