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【摘要】 目的 探讨胆红素脑病时不同浓度、时间脑损伤的脑源性神经营养因子（BDNF）表达变化情况。方法 制作100mg/kg、200mg/kg豚鼠胆红素脑病模型，分别在给予胆红素4h、8h后处死，采用免疫组织化学染色法检测脑组织内BDNF阳性神经元的数量。结果 100mg/kg、200mg/kg 4h的BDNF阳性神经元数量稍少于正常对照组，但差异无显著性，8h的BDNF阳性神经元数量明显多于正常对照组和4h组，差异有显著性。结论 BDNF在胆红素脑病早期，BDNF稍少，可能是：（1）在神经保护和修复中消耗大量BDNF，短期内代偿不足；（2）胆红素脑病初期是可逆的。不足以刺激神经元产生大量BDNF，随着损伤和时间延长。BDNF表达明显增高，有对抗损伤和修复受损神经元作用。
【关键词】 胆红素脑病；脑源性神经营养因子；免疫组织化学染色法；表达
A study on expressional change of brain-derived neurotrophic factor in newborn rat bilirubin encephalopathy
HE Ping,WANG Ting-hua,DU Kai-Xian,et al.
The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,China
【Abstract】 Objective To study expressional change of BDNF in newborn rat bilirubin encephalopathy.Methods Newborn rat (4～6d after birth) with bilirubin encephalopathy were induced by administration intra-peritoneally with bilirubin (100mg/kg,200mg/kg),using immunohistochemical reaction to detect BDNF.Results (100mg/kg,200md/kg)after 4 h,BDNF positive neurons are little decreased,after 8 h,BDNF positive neurons are much more increased.Both that are compared with normal newborn rat.Conclusion In early bilirubin encephalopathy.BDNF expression are little decreased(P＞0.05),in latter bilirubin encephalopathy.BDNF expression are much more increased(P＜0.01).
【Key words】 bilirubin encephalopathy;brain-derived neurotrophic factor;immunohistochemicstry;expression
胆红素脑病是新生儿高胆红素血症最严重的并发症，死亡率高，幸存者约75%～90%有神经系统后遗症（如手足徐动症型脑瘫），是导致智力低下、视听障碍的重要原因之一［1］。目前尚无一种有效合理预防和治疗胆红素脑病的方法。因此，对胆红素脑病的早期预防、干预和治疗的研究就显得尤为重要。近年来，脑源性神经营养因子（BDNF）的神经保护、修复和促使神经元再生在许多神经系统异常（如缺氧缺血性脑病、脑卒中、癫痫、脑外伤、神经退行性病变等）中的作用越来越受到重视。众所周知，BDNF是神经营养因子家族成员之一，它不仅在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能起关键的作用，而且还具有抗损伤性刺激，促使神经元损伤后的再生作用［2］。本研究旨在研究胆红素脑病脑组织中BNDF表达变化的规律，为进一步探讨治疗胆红素脑病及预防其后遗症提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
由昆明医学院实验动物中心提供出生4～6天豚鼠50只，体重40～60g，随机分为5组，每组10只。即对照组C组；N14h组：100mg/kg；N18h组：100mg/kg；N24h：200mg/kg；N28h组：200mg/kg。
1.2 胆红素脑病模型制作［3］
避光称取实验所需胆红素，每20mg胆红素溶于1mg 0.5M NaOH溶液中，加入双蒸水9ml，用0.5M HCl调至pH8.5，在1h内用。N14h组10只豚鼠腹腔注射胆红素100mg/kg，4h后灌杀；N18h组10只豚鼠腹腔注射胆红素100mg/kg，8h后灌杀；N24h组10只豚鼠腹腔注射胆红素200mg/kg，4h后灌杀；N28h组10只豚鼠腹腔注射生理盐水0.5ml，8h后灌杀。
1.3 动物模型验证
动态观察各组动物神经行为改变，每组随机抽取豚鼠1只，分别抽血查胆红素浓度、脑组织切片，光镜下观察胆红素沉积，电镜下观察神经元的改变，以验证胆红素脑病模型是否成功。
1.4 取材
各组动物按设计方案在给胆红素后4h、8h分别麻醉。用温0.01 M PBS 100ml灌注心脏3～5min后，再用4%多聚甲醛150ml灌注固定，然后取脑放入4%多聚甲醛后固定8～12h，最后取出置于20%蔗糖溶液中48h（于4℃冰箱中）沉底。48h后，将脑组织块固定在恒冷切片机上，行冠状连续切片（每片厚20mm），切片后用0.01 M PBS反复漂洗以将苦味酸的黄色洗去。
1.5 免疫组织化学检测［4］
切片按下列程序进行免疫组化染色：PBS 洗5min×3；3%H2O2，室温15min，PBS 洗5min×3；入Ⅱ抗（1∶200，PBS配），37℃ 15h；PBS 洗15min×3；入AB复合物（1∶100）37℃。1.5h；PBS洗5min×3；DAB黑色10min；PBS洗、裱片、脱水、树胶封片，并设置阴性对照试验，验证反应的特异性。
每列研究对象（包括对照组）选择大脑皮层及基底节区为观察区，每个部位取3个视野，用目镜带方格的100倍显微镜头对BDNF阳性细胞计数。
1.6 统计学方法
用统计学软件SPSS行成组t检验。
2 结果
2.1 胆红素脑病模型验证
见表1。光镜下观察N14h组、N18h组、N24h组、N28h组均可见胆红素在脑组织沉积。电镜下观察N28h组可见到线粒体肿胀，其他组未发现异常。表1 各组动物的神经系统表现观察 （略）
2.2 BDNF在大脑皮层及基底节区表达的变化
见表2。表2 各组BDNF在大脑皮层及基底节区表达的变化 （略）
从表2可看出，与C组比较，N14h组BDNF表达略减少，但差异无显著性（P＞0.05）；在N18h组BDNF表达明显增多，差异有显著性（P＜0.05）；N24h组BDNF表达略减少，但差异无显著性（P＞0.05）；N28h组的BDNF表达明显增多，差异有非常显著性（P＜0.01）；N14h组与N24h组比较，差异无显著性；N18h组与N28h组比较，差异有非常显著性（P＜0.01）；N28h组的BDNF明显高于N18h组。
3 讨论
3.1 胆红素脑病的基本损伤机制
目前胆红素脑病的基本机制还不是很明确，就现有的研究表明：其分子生物学机制为：（1）干扰脑细胞代谢。胆红素与神经细胞突触膜结合，使突触膜Na+-K+依赖性ATP酶活性下降，导致细胞外ATP减少，细胞内ATP堆积；（2）破坏细胞膜成分和功能，使细胞膜通透性增大，神经细胞内Ca2+超载；（3）抑制脑细胞蛋白质合成和糖原酵解过程［5］。其过程分为3个步骤：聚集、结合、沉积，在聚集、结合阶段，对神经细胞的损伤是可逆的［1］，临床使用脑干听觉诱发电位（BAEP），闪光视觉诱发电位（F-VEP）检测已出现异常，称为新生儿亚临床型胆红素脑病［6］。胆红素沉积阶段，此时胆红素在神经细胞膜上的沉积趋于饱和，并引起不可逆的脑损伤，如抽搐及听力障碍、智能障碍等后遗症［7］。
3.2 BDNF在脑组织中表达的分布及作用引起表达变化的因素
BDNF主要源于神经元，分布于大脑皮层、髓质、小脑、海马等中枢神经系统和感觉神经及脊髓运动神经元，另外在外周的心脏、肺、骨骼肌和坐骨神经，也已经检测到BDNF mRNA的存在。BDNF具有维持多类神经元存在，并直接促进轴突生长的作用，它促进神经脊源和基板源感觉神经元的发育，维持其存活；促进基底前脑乙酰胆碱神经元，中脑纹状体多巴胺脑神经元存活；维持视网膜神经带、颅神经和运动神经元的生长和存活；促进神经元修复和再生；减少运动神经元的正常凋亡［1］。
实验表明：脑损伤后有多种因素可引起BDNF的表达变化：（1）细胞Ca2+调节BDNF及其受体表达；（2）其他生长因子和细胞因子能刺激BDNF及其受体的表达；（3）神经递质性激素调节BDNF的表达［8］。
3.3 BDNF在胆红素脑病表达变化及可能发生机制
本研究发现：BDNF在大脑皮层和基底节区随胆红素浓度增加、脑损伤程度加重和时间延长而表达增加。N14h、N24h组的BDNF表达较C组稍少，但差异无显著性。此现象表明：（1）在胆红素所致脑损伤初期聚集、结合阶段，在保护神经元过程中，消耗BDNF，而BDNF表达代偿增加未能立即发生，估计此时已有BDNF mRNA的明显增加；（2）此时正处于胆红素对脑细胞毒性作用的聚集、结合的可逆损伤阶段，导致BDNF大量表达增加的因素尚不足以导致BDNF表达的明显增加，故BDNF表达稍少。随着时间延长和损伤的加重，细胞内Ca2+超载，细胞因子、生长因子、神经递质激素在损伤的作用下，明显增多，而这些因素都可导致BDNF表达上调。当然，还有其他的一些因素的作用，故BDNF表达增高。
3.4 BDNF在胆红素脑病中的双重作用
胆红素脑病的BDNF表达随时间延长及损伤加重而增加，提示BDNF对神经元损伤具有保护作用。BDNF通过其受体TrKB结合而发挥其相应的生物学效应。已有实验表明：脑损伤时，神经元胞内Ca2+的浓度升高，钙超载可通过多种机制引起神经元的凋亡，BDNF可使培养的海马神经元的钙结合蛋白（Ca2+CP）及其的mRNA的含量增加，这种Ca2+CP能使细胞内超量的Ca2+排出，而保护和修复受损神经元［9］。CNS耗氧较高而抗氧化酶较低，在脑损伤时易产生大量的自由基和高浓度的过氧化物酶而损伤神经元，BDNF在体外培养的神经元内可使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的含量明显增加，使自由基减少，以减轻自由基对神经元的损伤［10］。
BDNF增加大鼠皮层兴奋性突触后电流，BDNF还可增强体外培养的海马神经元N-甲基-D-天氡氨酸（NMDA）介导的突触传导。因此，BDNF一方面对抗细胞凋亡，另一面会增加神经细胞的兴奋性氨基酸毒性损害［11］。
如前所述，胆红素脑病时，胆红素可通过激活神经元谷氨酸受体和NMDA受体，神经元内Ca2+超载及其他生长因子和细胞因子等途径使BDNF表达增加，其早期可能通过维持细胞内Ca2+稳定、清除自由基、抑制细胞凋亡，实现对抗神经元损伤和修复受损神经元，但后期由于损伤加重和时间延长，BDNF的过度表达，可能除神经保护和修复作用外，还增加兴奋性氨基酸毒性的易感性，抵消BDNF对CNS细胞的保护和修复作用，加重胆红素对脑组织的损伤。内源性BDNF在不同损伤阶段、不同损伤程度中的具体作用尚需进一步研究。
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11 Kido N, Tanihara H, Honjo M, et al, Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in eyes with NMDA-induced neuronal death. Brain,2000,884(1～2):59.
作者单位： 650101 云南昆明，昆明医学院第二附属医院儿科
(编辑：丁剑辉)
(收稿日期：2005-11-27)