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凋亡细胞体外抑制T细胞活化
中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：张雷 孙尔维 葛琪 曾耀英 高伟
单位：张雷(第一军医大学珠江医院肾移植科，广州 510515)；孙尔维(第一军医大学珠江医院肾移植科，广州 510515)；葛琪（暨南大学组织移植与免疫国家专业实验室，广州 510632）；曾耀英（暨南大学组织移植与免疫国家专业实验室，广州 510632）；高伟(第一军医大学珠江医院肾移植科，广州 510515)
关键词：凋亡细胞；免疫抑制；T细胞活化；CD69
摘 要 目的：研究凋亡细胞对T细胞活化的影响。方法：以ConA刺激小鼠脾细胞增殖体系为研究对象，观察凋亡细胞预处理后对ConA刺激的脾细胞CD69表达的影响。结果：凋亡细胞可以抑制T细胞活化，而活细胞或坏死细胞却不能，同时抑制效果与凋亡种类及凋亡诱导方式无关，而与凋亡细胞数量密切相关。结论：研究证明了凋亡细胞可以主动抑制T细胞活化，这一发现拓宽了目前对凋亡的认识，表明凋亡细胞主动调节免疫反应在一些生命的基本现象和一些疾病中有重要意义。研究凋亡细胞对T细胞活化的影响。方法：以ConA刺激小鼠脾细胞增殖体系为研究对象，观察凋亡细胞预处理后对ConA刺激的脾细胞CD69表达的影响。结果：凋亡细胞可以抑制T细胞活化，而活细胞或坏死细胞却不能，同时抑制效果与凋亡种类及凋亡诱导方式无关，而与凋亡细胞数量密切相关。结论：研究证明了凋亡细胞可以主动抑制T细胞活化，这一发现拓宽了目前对凋亡的认识，表明凋亡细胞主动调节免疫反应在一些生命的基本现象和一些疾病中有重要意义。
中国图书分类号 R392.12
An in vitro study of the inhibition of T cell activation by apoptotic cells
ZHANG Lei，SUN Er-Wei，GE Qi et al.
Spleen Transplantation Department of Zhujiang Hospital，1st Military Medical University，Guangzhou 510515
Abstract Objective:To investigate the significance of apoptotic cells on the activation of T cells.Methods:CD69 expression was detected on spleen T cells finst conditioned by apoptotic cells and then stimulated by ConA.Results:Apoptotic cells actively inhibited T cell activation while viable and necrotic cells did not.The inhibition was correlated with apoptotic cell number，but independent of apoptotic inducers.Conclusion:The results demonstrate that apoptotic cells actively participate in the regulation of T cell activation ，suggesting the changes of immune system or the development of immune tolerance may be correlated with apoptosis.
Key words Apoptotic cell Immunosuppression T cell activation CD69
细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象。它与坏死的一个主要的区别是凋亡细胞在裂解之前即可很快被体内的清道夫细胞(scavenger)所清除，而不引起炎症反应。长期以来人们发现紫外线和X线对一些无菌性炎症如银屑病、肩周炎、动脉炎等具有良好的疗效［1］，因为用杀菌不能解释其机理，而促使人们联想到，紫外线和X线作为强烈的凋亡诱导剂，是否诱导了局部的细胞凋亡而抑制了炎症反应?即凋亡细胞不仅仅是被快速吞噬而被动地避免炎症反应，而是主动地抑制炎症反应呢?
Fadok发现巨噬细胞大量吞噬凋亡细胞时，其IL-1β、IL-8、IL-10、GM-CSF以及TNF-α分泌受到抑制，而TGF-β1的产生增加［2］。Voll等发现在LPS刺激外周血淋巴细胞(PBMC)的反应体系中加入凋亡细胞，不仅可抑制IL-12、IL-1β和TNF-α等炎性因子的分泌，而且促进IL-10产生，同时指出凋亡细胞的这种效应由抗原提呈细胞表面的(APC)CD36分子介导［3］。这些实验证明凋亡细胞具有主动调节淋巴因子分泌方式的作用，并提示这种作用是使免疫细胞分泌的淋巴因子由TH1向TH2转化。但这两个实验的结果并非完全一致，特别对IL-10的实验结果出现了明显的分歧。我们知道，淋巴因子的作用具有多向性(pleiotropism)，那么凋亡细胞主动调节淋巴因子分泌方式最终会对免疫系统，特别是免疫反应中最重要的效应细胞T细胞产生何种影响呢?
T细胞活化后诱导表达一些膜蛋白分子，如IL-2受体(CD25)、转铁蛋白受体(CD71)和CD69，这些分子被称为活化标志［4］。CD69是已知的T细胞活化时表达最早的一个膜抗原，活化后1至2 h即可在细胞膜表面发现该分子的表达［5］。本实验以ConA刺激小鼠脾细胞增殖体系为实验对象，T细胞表面CD69为观察指标，研究凋亡细胞对T细胞活化的影响，从而探讨凋亡细胞对免疫系统的作用。
1 材料与方法
1.1 动物 Balb/c纯系小鼠，雄性，6～8周龄，购自中山医科大学实验动物中心。
1.2 试剂 FTY720系日本福吉药厂生产，日本京都府立医科大学中岛启雄博士惠赠，放线菌酮(CHX)购自美国CALBIOCHEM公司，刀豆素A(ConA)美国SIGMA公司生产，RPMI1640和胎牛血清购自美国HYCLONE公司，AnnexinV-FLUOS试剂盒购自德国BOEHRINGER MANNHEIM，所用抗小鼠单隆抗体见表1。
1.3 药物诱导K562、HL-60细胞凋亡 K562、HL-60细胞在RPMI1640培养液(含10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，5×10-5mol/L 2-ME，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)中进行传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。凋亡诱导时，于2×105 ml-1的K562或HL-60细胞中加入FTY720(终浓度50 μmol/L)或CHX(终浓度50 μmol/L)，CO2，37℃孵育14 h，PBS洗4次(300 g，5 min，4℃)，记数，备用。
1.4 凋亡细胞检测 0.4%台盼蓝侵染检测细胞膜完整性。106细胞PBS洗1遍，去上清后加入Annexin-V染液100 μl，15 min后荧光显微镜(Nikon)观察、拍照(530 nm滤光片)。发绿光荧光为Annexin-V阳性。与常光照片对照计算凋亡率。
1.5 K562细胞坏死 106 K562细胞悬于PBS溶液中，56℃水浴1 h，0.4%台盼蓝侵染检查细胞活率(侵染阳性率＞90%)，PBS洗1次，备用。
1.6 小鼠脾细胞活化 无菌条件下取Balb/c小鼠脾脏，碾磨后细胞悬于RPMI1640培养液(含20%胎牛血清，余同1.3)，100目尼龙网滤过。0.4%台盼蓝侵染检查细胞活率(＞98%)，3%乙酸溶液稀释记数。2×106脾细胞与凋亡(实验组)或活的、坏死的(对照组)细胞共同孵育2 h(5%CO2，37℃)后，加入ConA(10 μg/ml)，继续孵育6、20 h后分别取样检测。
1.7 淋巴细胞荧光抗体标记 三色直接荧光标记法：6×105脾细胞，PBS洗1次，去上清，加入anti-CD3-PE，anti-CD8-Cy-Chrome，anti-CD69-FITC各10 μl，室温孵育30 min，PBS洗1次，1%多聚甲醛固定10 min后流式细胞仪分析。
1.8 流式细胞仪数据获取及分析 全部数据用流式细胞仪(FACStarplus，美国BD公司)和软件LYSYSⅡ进行三色荧光参数获取及分析。简述如下：在前散射(FSC)和侧散射(SSC)的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区(R1)，然后对淋巴细胞作PE、FITC和Cy-Chrome荧光强度检测，其中荧光1(FL1)为FITC，滤光片带通为(530±10)nm，荧光2(FL2)为PE，滤光片带通为(575±10)nm，荧光3.1(FL3.1)为Cy-chrome，滤光片带通为(660±10)nm。先根据淋巴细胞PE荧光强度划出CD3+T细胞区(R2)，再检测T细胞FITC和Cy-Chrome荧光强度，数据显示于双色Dot-plot(FL1 vs FL3.1)图中。数据分析时，根据Isotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阳性、双阴性和单阳性区。
1.9 统计学处理 全部数据均由SPSS7.5软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 ConA刺激下小鼠T细胞表面CD69的表达 刺激前T细胞表面CD69弱表达(＜10%)。ConA刺激2 h后，即可观察到CD69表达开始增多，4～6 h达到峰值(＞80%)，24 h出现下降趋势。这与文献［6］报道的PMA刺激下的T细胞CD69表达动力学基本一致。
2.2 FTY720诱导的K562凋亡细胞抑制T细胞CD69的表达 FTY720是一种新型的免疫抑制剂，它可以特异性诱导淋巴细胞凋亡［7］。K562是人淋巴母细胞瘤株，我们用FTY720来诱导K562凋亡，达到了良好的效果，坏死率＜5%(台盼蓝染色阳性)，凋亡率＞90%(AnnexinV染色阳性)，在体外刺激脾细胞(2×106)增殖的反应体系中加入4×105凋亡K562细胞，可显著抑制T细胞CD69的表达，6 h时CD69阳性率由对照组的86.33±36.63 降至31.17±8.81，而活的或坏死的K562细胞都没有这种作用。这种抑制作用有时效性，在20 h时已无统计学差异(见图1、表2)。
表1 本实验所用抗小鼠单克隆抗体
Tab.1 Antimouse monoclanal antibodies used in the study
| Species | Isotype | Clone | PN | Company | Nation | |
| CD3-PE | RAT | IgG2a | KT3 | IM2769 | IMMUNOTECH | FRANCE |
| CD8-Cy-Chrome | RT | IgG2a，k | 53-6.7 | 01504D | PHARMINGEN | USA |
| CD69-FITC | HAMSTER | IgG，group1，λ | H1.2F3 | 01048A | PHARMINGEN | USA |
图1 凋亡细胞暂时性抑制ConA刺激下小鼠CD3＋脾细胞CD69的表达
Fig.1 Apoptotic cells transiently inhibited the ConA-induced expression of CD69 on mouse CD3+ splenocytes
表2 凋亡细胞抑制T细胞CD69表达(
Tab.2 Apoptotic cells inhibit CD69 expression on T cells(
| S | S+A | S+A+F | S+A+N | S+A+Apo | |
| 6 h | 9.73±1.38 | 86.8±3.631) | 86.1±0.251)2) | 89.9±3.231)2) | 31.2±8.811)3) |
| 20 h | 8.60±0.87 | 69.8±14.81) | 71.6±10.11)2) | 81.1±3.511)2) | 55.4±7.341)4) |
Note:S:spleen cells;A:ConA;F:fresh K562 cells;N:necrotic K562 cells;Apo:Apoptotic K562 cell;P＜0.001 between groups(AVON method);1)P＜0.001 vs S group;2)P＞0.05 vs S+A group;3)P＜0.001 vs S+A group;4)P=0.073 vs S+A group
2.3 FTY720诱导的HL-60凋亡细胞也可抑制T细胞CD69的表达 是否只有K562的凋亡细胞才能抑制T细胞CD69的表达呢?有报道FTY720可诱导HL-60细胞凋亡［8］。我们用与2.2相同的方法诱导HL-60细胞凋亡，结果坏死率＜5%，凋亡率＞90%。在体外刺激脾细胞增殖的反应体系中加入4×105凋亡HL-60细胞，可显著抑制T细胞CD69的表达，6 h时CD69阳性率由对照组的86.33±3.63降至29.47±4.56(P=0.001)，而凋亡的K562与HL-60细胞之间没有显著性差异(P=0.251，见图2)。
2.4 CHX诱导的K562、HL-60凋亡细胞也可抑制T细胞CD69的表达 凋亡细胞抑制T细胞CD69的表达是否与凋亡诱导剂FTY720有关?我们用另一种凋亡诱导剂CHX诱导K562和HL-60细胞凋亡，结果坏死率＜5%，凋亡率分别为56%和48%。在体外刺激脾细胞增殖的反应体系中分别加入4×105凋亡K562和HL-60细胞，可显著抑制T细胞CD69的表达(P＜0.001)，6 h时CD69阳性率分别为49.2±7.13和54.77±2.90，2种细胞间无显著性差异(P=0.279，见图3)。
2.5 凋亡细胞抑制T细胞CD69表达存在量效关系 我们注意到CHX诱导下的凋亡率低于FTY，相应的其凋亡细胞抑制CD69表达的效果也不如FTY，这提示凋亡细胞数与CD69表达率之间存在相关性。我们将加入脾细胞增殖的反应体系中的凋亡细胞数量由0×104逐渐增至40×104时，T细胞CD69表达率逐渐下降(见图4)。
图2 FTY720诱导的K562、HL-60凋亡细胞抑制T细胞CD69的表达
Fig.2 Apoptotic K562 and HL-60 cells induced by FTY720 inhibited the expression of CD69 on T cells
图3 CHX诱导的K562和HL-60凋亡细胞抑制细胞CD69的表达
Fig.3 Apoptotic K562 and HL-60 induced by CHX inhibited the expression of CD69 on T cells
图4 凋亡细胞抑制T细胞CD69表达的量效关系
Fig.4 The relationship of apoptotic cell number with the expression of CD69 on T cells
2.6 凋亡细胞对T细胞亚群的影响 ConA刺激小鼠脾细胞，CD3+T细胞的CD69表达无论在早期(6 h)或晚期(20 h)都没有显著差异。凋亡细胞抑制CD69表达的作用在CD8+和CD8-亚群却存在差异性。早期当凋亡细胞显著抑制T细胞CD69表达时，CD8-亚群的CD69表达率显著高于CD8+亚群(44.2% vs 33.3%)。晚期，当凋亡细胞的抑制作用已不显著时，CD8-亚群的CD69表达率又显著低于CD8+亚群(42.2% vs 85.5%)。这提示，凋亡细胞对Th的抑制作用相对缓慢而持久，而对于Tc的抑制作用则迅速而短暂。
3 讨论
凋亡是一个普遍存在的生理现象，用以清除体内无用的、年老的和危险的细胞。胚胎发育、T细胞胸腺内成熟以及炎症后大量中性粒细胞的清除都依赖于这一机制。与坏死不同，凋亡的局部不发生炎症反应。长期以来，人们都以凋亡细胞膜结构的完整性作为解释这一现象的唯一原因。近来，有学者发现凋亡细胞可主动调节免疫细胞淋巴因子的分泌，使之由Th1向Th2转化。本文发现凋亡细胞可抑制T细胞活化，进一步证明凋亡细胞不仅仅被动避免了炎症反应而且具有主动的免疫抑制作用。
那么，产生这种免疫抑制作用的具体机制是什么呢?本文的结果显示凋亡细胞可抑制T细胞活化而同源活细胞和坏死细胞却不能，而且抑制效果与凋亡细胞种类及凋亡诱导方式无关，而与凋亡细胞数量密切相关，这提示这种抑制作用缘于细胞凋亡时共有的特异性改变。我们认为这种改变的被识别及识别后的信号传导可能最终导致了免疫抑制作用的产生。
细胞凋亡时膜表面的改变主要有：①不成熟糖基外露；②膜磷脂分布改变引起膜不均衡性(asymmetry)的丧失和以磷脂酰丝氨酸(phosphtidylserine，PS)为代表的带负电荷磷脂外翻［9］。目前已被报道的相关吞噬细胞膜表面受体有：①某些选择素(Lectins);②A类吞噬受体(Calss A Scavenger receptor);③粘合素超家族成员αvβ3；④CD36(属于B类吞噬受体)；⑤CD14等。除选择素的配体是寡糖外，其它受体的配体都为带负电的磷脂类基团［10］。其中αvβ3和CD36与负电基团的结合是通过血栓海绵蛋白(thrombospondin TSP)桥联的。
凋亡细胞的膜表面改变涉及的是糖类和磷脂等简单分子，种属间高度保守。为何对如此简单而保守的改变在进化过程中生物仍保留了如此繁多的认别受体系统?这提示我们这些受体识别凋亡细胞并不是仅仅为简单的吞噬，而可能包含有较复杂的信号传递过程。已有的实验证据表明CD36和CD14参与了凋亡细胞与吞噬细胞间的信号传导［3，11］。我们推测，吞噬细胞(主要是巨噬细胞)表面CD36和/或CD14结合并识别凋亡细胞表面特异性磷脂后，淋巴因子分泌方式改变，通过旁分泌作用于T细胞，抑制其活化。事实是否如此?为何这种抑制作用对不同的T细胞亚群存在差异?是否是因为淋巴因子作用的选择性?凋亡细胞是否可能直接作用于T细胞?这些都还需要进一步的实验证实。
凋亡细胞的免疫抑制作用有何生物学意义?笔者认为这很可能是一种保险机制(fail-safe mechanism)。凋亡是一个死亡过程而非一种静止的状态，发生凋亡的细胞如不被迅速吞噬最终将发生坏死，为避免坏死细胞内物质释出引起炎症反应，造成组织损伤，机体在局部营造了免疫抑制微环境。而在体内胸腺不断有大量不成熟T细胞凋亡，胚胎发育过程中大量滋养层细胞凋亡，肿瘤中也存在大量凋亡细胞，这些是否是造成胸腺“特殊微环境”，使其成为诱导免疫耐受的特殊部位的原因［12］?是否是母体不排斥异基因胚胎的机制之一?是否是肿瘤局部浸润抗原提呈细胞低表达B7造成“免疫逃避”的因素?对于这些免疫学长期悬而未决的问题，本文的结果可能会有所提示。
本课题受军队卫生课题资助(No.98H012)
作者简介：孙尔维，男，37岁，硕士，副主任医师，副教授，主要从事移植免疫与免疫学研究
4 参考文献
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［收稿：1999-06-15］