野生型p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备

野生型p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 免疫学技术与方法

作者：孔祥波　谷新权　马庆杰

单位：孔祥波（白求恩医科大学第三临床医学院泌尿外科，长春 130021）；谷新权（白求恩医科大学第三临床医学院泌尿外科，长春 130021）；马庆杰（白求恩医科大学第三临床医学院核医学科，长春 130021）

关键词：野生型p53基因；DU145；核酸疫苗

　　摘　要　目的：制备具有治疗活性的野生型p53基因真核表达载体的细胞疫苗。方法：利用RT-PCR从人外周血淋巴细胞总mRNA中扩增出全长的野生型p53基因，将其克隆入TA克隆载体，经扩增后，将p53cDNA连入pCMV真核表达载体中。利用lipofectamine将其转染DU145细胞并通过免疫组化的方法检测其表达情况。结果：p53基因可在DU145细胞中稳定表达。结论：制备了可稳定表达于DU145细胞中的野生型p53基因细胞疫苗。

　　中国图书分类号　R737.25　R730.43

Construction of wide-type p53 gene vaccine

KONG Xiang-Bo，GU Xin-Quan，MA Qing-Jie.

　　The Third Clinical College，Norman Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130031

　　Abstract　Objective:To construct a wide-type p53 gene vaccine which has the therapeutic activity.Methods:We get the intact wide-type p53 gene from human peripheral lymphocyte total mRNA using RT-PCR，then cloned it to TA vector and link to pCMV after gene amplification.pCMV-p53 expression vectors were transfected in DU145 using lipofectamine and the protein was detected by immunohistochemistry.Results:p53 gene can express stability in DU145.Conclusion:We constructed a p53 gene vaccine what can express stability in Du145 cell line.

　　Key words Wide-type p53 gene　DU145　Gene vaccine

　　近年来，人们对p53基因在肿瘤发生和发展方面的作用产生了浓厚兴趣。经过大量研究，现在认为野生型p53基因在正常条件下能抑制细胞生长和促进分化，当该基因发生突变缺失时，这种抑制功能即丢失，使细胞易向恶性转化。还有证据表明，突变的p53具有直接致癌作用^［1］。在正常细胞中p53基因表达较少，而在肿瘤细胞中，往往具有高度表达的突变型的p53。因此本研究拟构建一个可表达于前列腺癌细胞系内的野生型p53基因疫苗，为前列腺癌的基因治疗打下了基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　Trizol mRNA提取试剂盒，TA克隆载体，pCMV真核表达载体，lipofectamine美国Gibco公司。DU145人前列腺癌细胞系由美国Florida大学Hobeika-AC博士惠赠，T7聚合酶DNA测序试剂盒，美国Promega公司。

　　1.2　人外周血淋巴细胞总mRNA提取　利用Trizol mRNA提取试剂盒，按操作手册进行。

　　1.3　RT-PCR扩增p53基因的cDNA　上游引物序列为：5’-GCTTCTGACCTACTGACG-3’；下游引物序列为：5’-CCCGGACAGAGTCTGACT-3’。扩增长度为1 184 bp。RT-PCR反应条件为：1×PCR标准缓冲液，0.2 mm/L dNTP，上下游引物各50 pmol/L，2单位逆转录酶。反应在50 μl体积中进行。循环温度设计为94℃1 min，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共进行45个循环。

　　1.3　按TA克隆及DNA序列测定　DNA序列测定　按TA克隆及T7聚合酶试剂盒说明书进行。

　　1.4　pCMV-p53真核表达载体的构建　TA克隆扩增后，利用EcoRI和BamHI双酶切将p53cDNA切下，克隆入pCMV真核表达载体中，利用酶切鉴定连接的正确性。

　　1.5　转染　DU145细胞1.5×10⁶在100×15 mm的塑料平皿中过夜培养，粘附于平皿上。3 ml IMDM冲洗然后加入6 ml IMDM含有lipofectamine 1.67 μg/ml 37℃ 5%CO₂孵育6 h。对照组同样方法转染pCMV空载体转染后细胞在400 μg/ml Geneticin 中培养以筛选出阳性克隆^［2］。

　　1.6　p53基因表达产物的检测　p53基因产物的表达选用Do-7单克隆抗体(美国DAKO公司产品)和HRP标记羊抗鼠IgG，常规方法染色。

　　2　结果

　　RT-PCR反应后在有wtp53转染的DU145细胞中有一特异性的PCR产物，长度为1 124 bp，说明转染DU145细胞后，wtp53仍稳定地存在于wtp53重组体中。免疫组化可见胞浆中有wtp53基因产物，而对照组则没有。说明p53可稳定地表达于DU145细胞中。

　　3　讨论

　　p53基因定位于人类17号染色体短臂1区内，全长约20 kb，由11个外显子和10个内含子组成^［3］。p53基因转录产生约2 kb mRNA，编码一个393个氨基酸的蛋白，分子量为53 kD^［4］，本研究用RT-PCR技术将p53基因起始密码子与终止密码子之间cDNA序列扩增出来，重组到真核表达载体pCMV中，并在DU145细胞中得到了稳定表达。

　　目前用于转染外源基因的真核表达载体主要包括逆转录病毒载体，腺病毒载体和脂质体载体。一个有效的基因转移载体主要特征是：①靶细胞的特异性，即载体只作用于某一特定细胞；②转染的高效性；③基因表达的持续性；④载体的安全性；⑤生产过程和使用的简单性；⑥费用低廉。与其它两种载体相比，脂质体载体具有第一条以外的全部优点，且这一缺陷可通过基因疫苗在体内的局部注射而得以弥补。

　　p53基因为抑癌基因，已有研究表明，携带有野生型p53基因的腺病毒载体，可抑制前列腺癌Tsu-Pr1、PCm-3、C4-3、DU145等细胞系的生长，并诱导其调亡，而体内研究表明，p53可以有效地抑制在裸鼠中C4-2前列腺癌的生长和PSA的产生^［5］。本研究所制备的野生型p53基因脂质体转染的核酸疫苗，较之已有的表达系统有一定的优势，为前列腺癌的基因治疗打下了基础。

　　本课题受吉林省卫生厅科研基金资助

　　作者简介：孔祥波，男，48岁，教授，主要从事泌尿系统肿瘤研究工作

　　4　参考文献

　　［1］Michalovity，Halevy O，Oren M et al. p53 mutotion:gains or losses? J Cell Biochem，1991;45:22

　　［2］Janice DeMoor， Mark Vincent，Olga Collins.Antisense nucleic acids targeted to the thymidylate synthase(TS) mRNA translation start site stimulate TS cebe transcription. Experimental Cell Research，1998;243:11

　　［3］Lamb P，Crawford L.Characterixation of the human p53 gene.Mol Cell Biol，1986;6:1379

　　［4］Levine A J，Momand J，Finlay C A et al. The p53 tumor suppressor gene.Nature，1991;351:453

　　［5］黄俊，王立明.前列腺癌基因治疗的研究现状.国外医学*泌尿系统分册，1997；17(3)：195

［收稿1999-10-14　修回2000-04-11］