髓磷脂碱性蛋白促进单个核细胞对内皮细胞的粘附效应

髓磷脂碱性蛋白促进单个核细胞对内皮细胞的粘附效应

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 神经内分泌与免疫

作者：刘红岩　杨贵贞

单位：刘红岩（白求恩医科大学基础医学院免疫教研室，长春 130021）；杨贵贞（白求恩医科大学基础医学院免疫教研室，长春 130021）

关键词：粘附；细胞间粘附分子-1；血管细胞粘附分子-1；髓磷脂碱性蛋白

　　摘　要　目的：探讨MBP对外周血单个核细胞(PBMNC)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附性的影响，以揭示中枢神经系统(CNS)炎症时PBMNC进入CNS的可能原因。方法：用细胞粘附试验，研究PBMNC与HUVEC的粘附性，用细胞免疫化学法、FACS分别观察VCAM-1和ICAM-1的表达。结果：MBP活化的PBMNC与MBP刺激的PBMNC培养上清作用的HUVEC的粘附性较对照有显著提高。ICAM-1单抗和可溶性VCAM-1(sVCAM-1)可抑制二者间的粘附。进一步证明该上清可诱导HUVEC表达VCAM-1并可提高ICAM-1的表达量，MBP可刺激PBMNC产生TNF，后者刺激HUVEC产生ICAM-1和VCAM-1，从而促进PBMNC与HUVEC的粘附。结论：MBP可促进PBMNC与HUVEC的粘附，因此在CNS炎症时MBP对PBMNC进入CNS可能起重要作用。

　　中国图书分类号　R392.1

Myelin basic protein promote the effect of peripheral blood mononuclear cells adhesion to human umbilical vein endothelial cells

LIU Hong-Yan，YANG Gui-Zhen.

　　Department of Immunology，Norman Bethune University of Medical Sciences，Changchun130021

　　Abstract　Objective:To study the influence of MBP to the adhesion of PBMNC to HUVEC，in order to explore possible reason of the PBMNC entering CNS in CNS inflammation.Methods:The adhesion test of cell was used to study the adhesion of PBMNC to HUVEC.Immunocytochemistry and FACS were used to test the expression of ICAM-1 and VCAM-1.Results:Compared with control，much more adhesion cells were showed during PBMNC stimulated by MBP adhesion to HUVEC culturing with the supernatant of MBP stimulating PBMNC.Either anti-ICAM-1 McAb or sVCAM-1 can inhibit the PBMNC-HUVEC adhesion.Furthermore，the supernatant can induce VCAM-1 expression and improve the amount of ICAM-1 on HUVEC.Meanwhile，it was showed that MBP can stimulate PBMNC to secrete TNF.TNF can induce the expression of ICAM-1 and VCAM-1，the latter can promote PBMNC-HUVEC adhesion.Conclusion:MBP can promote the adhesion of PBMNC to HUVEC and may play an important role during PBMNC infiltration to CNS in CNS inflammation.

　　Key words Adhesion　ICAM-1　VCAM-1　MBP

　　髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是存在于中枢神经系统髓质内的主要蛋白，是引起中枢神经系统炎症的主要自身抗原，在中枢神经系统炎症时，大脑及脊髓的血管周围有大量的单个核细胞浸润，在CNS造成炎性损伤。为了探讨外周血单个核细胞进入CNS的机制，体外研究了MBP对外周血单个核细胞与内皮细胞粘附性的影响，为进一步阐明中枢神经系统炎症的发病机制打下基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　MBP　从牛的脑脊髓中提取，通过反复去脂，抽洗，酸抽提，高速离心等步骤，得到电泳为一条主带的MBP。

　　1.1.2　试剂　胰蛋白酶(上海Songon公司产品)，IMDM培养基(Takaro公司产品)，小鼠抗人CD45，ICAM-1(冯彪博士后惠赠)，sVCAM-1(Dr.Roy Lobb 惠赠)，小鼠抗人VCAM-1(迈新公司)。

　　1.1.3　脐带　剖宫产健康新生儿脐带，取自长春市妇产医院。

　　1.2　方法

　　1.2.1　HUVEC的培养　见参考文献［1］，在无菌条件下，取健康新生儿的脐带20～30 cm，用Hank's液反复冲洗至无血迹，灌入0.25%的胰酶，置37℃温箱中孵育15～20 min，倒出消化液，用含20%小牛血清的IMDM培养液冲洗，消化液与培养液置于离心管，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入培养液调细胞浓度5×10⁵/ml，置96孔板培养2～3 d至融合。

　　1.2.2　MBP刺激的外周血单个核细胞(PBMNC)　无菌取健康人外周血，用Ficoll淋巴细胞分层液分离得到PBMNC，调细胞浓度为1×10⁷，分为加MBP组(MBP终浓度为50 μg/ml)和对照组(不加MBP)。

　　1.2.3　粘附活性的测定^［2，3］　培养的HUVEC在96孔板长成致密单层后，分为两组，一组加入MBP刺激的分离的PBMNC的24 h的培养上清，另一组为对照。5%CO₂孵箱培养6 h，倾去培养液，用IMDM培养液洗涤2次后，在孔中加入MBP刺激培养72 h和正常培养72 h PBMNC，2×10⁵/孔，设3复孔，37℃孵育1 h，用温Hank's洗去未粘附PBMNC。用含0.15%EDTA与0.05%胰酶的IMDM 100 μl 37℃孵育20 min，洗去粘附的淋巴细胞，加至另一96孔培养板，进行记数，每孔加100 μl 37℃含20%小牛血清的IMDM和10 μl(5 mg/ml)MTT，37℃5%CO₂孵箱培养6 h，于每孔加入100 μl SDS-甲酰胺溶液，室温放置1 h，测OD570nm值，用570nm值衡量粘附细胞的量。

　　1.2.4　可溶性粘附分子及抗粘附分子抗体对粘附的影响　HUVEC细胞长成致密单层后，加入MBP刺激PBMNC的培养上清，孵育6 h，一组加入CD54抗体(1：60稀释)，另一组作为对照。同时，将经MBP刺激的PBMNC分为：对照组，加入sVCAM-1(5 ng/ml)组，加入抗CD45(1：10稀释)组，孵育30 min。然后按下列情况进行粘附性实验：(1)HUVEC+PBMNC；(2)抗CD54-HUVEC+PBMNC；(3)HUVEC+抗CD45-PBMNC；(4)HUVEC+sVCAM-1-PBMNC。37℃ 5%CO₂孵箱中孵育1 h，同上洗涤未粘附的细胞，测定OD570nm值。

　　1.2.5　TNF活性的测定　收集MBP刺激的PBMNC 24，48，72 h的培养上清，用L929细胞毒活性法进行测定，参见文献［4］。分别测定1：1，1：20稀释的24 h，48 h，72 h的培养上清［细胞毒性(%)＝(1-实验孔OD570nm/对照孔OD570nm)×100%］。

　　1.2.6　HUVEC的VCAM-1的表达　将MBP刺激的PBMNC的24 h培养上清加至刚刚融合的原代培养的HUVEC，每孔200 μl，阳性对照用100 U/ml的TNF，阴 性对照仅加培养液，继续培养48 h，4.4%枸橼酸钠消化液进行消化，Cytospin甩片机400 r/min甩5 min，经丙酮固定后，进行细胞免疫化学染色。

　　1.2.7　HUVEC的ICAM-1的表达　同上制备细胞，使每组含HUVEC5×10⁵，加入FITC标记的小鼠抗人ICAM-1单抗，4℃孵育1 h，洗涤后，FCM检测，记数10 000个细胞。

　　2　结果

　　2.1　粘附活性测定　由图1可见，MBP刺激的PBMNC与HUVEC之间的粘附的细胞数较对照无显著性差异(P＞0.2)，PBMNC与加入MBP刺激PBMNC培养上清的HUVEC之间的粘附的细胞数与对照相比有差异(P＜0.05)，MBP刺激的PBMNC与加入MBP刺激PBMNC培养上清的HUVEC之间的粘附的细胞数与对照相比有明显差异(P＜0.01)。

　　2.2　粘附分子抗体和可溶性粘附分子对粘附的影响　由图2可以看出抗CD54抗体和sVCAM-1对MBP刺激的PBMNC与加入MBP刺激的PBMNC培养上清的HUVEC之间的粘附有明显的抑制作用(P＜0.05)，而抗淋巴细胞共同抗原CD45的抗体却未见抑制作用。

　　2.3　TNF活性的测定　由图3可以看出，MBP刺激的PBMNC培养上清中含有TNF，24 h的培养上清中含量最高，随着时间的延长开始下降。

　　2.4　HUVEC表达的VCAM-1的细胞免疫化学检测　结果表明，经MBP刺激的PBMNC培养上清作用的HUVEC表达VCAM-1，而正常HUVEC未见有阳性细胞，TNF作用的HUVEC几乎都为阳性细胞。

　　2.5　HUVEC表达的ICAM-1的FCM定量鉴定　细胞免疫组织化学发现正常HUVEC也表达ICAM-1，为证明MBP对HUVEC的培养上清对HUVEC表达ICAM-1的影响，进一步用流式细胞术进行分析，结果表明，正常HUVEC有47.2%表达ICAM-1，经MBP刺激的PBMNC的培养上清作用后，表达量提高至60.5%，而TNF作用的HUVEC有更高的表达，可至65.5%。

图1　MBP和MBP刺激的PBMNC培养上清对PBMNC与HUVEC粘附性影响(n=3)

　　Fig.1　The effect of MBP and the culture supernatant of MBP stimulating PBMNC to PBMNC adhesion to HUVEC(n=3)

　　Note:　4 vs 1 P＜0.01 3 vs 1 P＜0.05

图2　粘附分子抗体及可溶性粘附分子对MBP刺激的PBMNC与加入MBP刺激的PBMNC培养的HUVEC间粘附性的影响(n=3)

　　Fig.2　The effect of AM antibodies and soluble AMs to the adhesion between PBMNC stimulated by MBP and HUVEC stimulated by the culture supernatant of MBP stimulating PBMNC(n=3)

　　Note:　3 and 4 vs 1，P＜0.05

图3　MBP刺激PBMNC培养上清中TNF活性的检测(n=3)

　　Fig.3　The test of TNF activity of the culture supernatant of MBP stimulating PBMNC(n=3)

　　3　讨论

　　MBP是诱导中枢神经系统炎症的主要抗原，探讨MBP在CNS炎症时单个核细胞浸润中的作用，对阐明中枢神经系统炎症发病机制非常重要。由于存在血脑屏障，正常状态下，免疫细胞很少能穿过脑内皮细胞进入CNS，在炎症状态下，却有大量的单个核细胞浸入CNS。本实验观察到，MBP具有促进PBMNC粘附到内皮细胞的作用，用粘附分子ICAM-1抗体和可溶性粘附分子sVCAM-1可抑制这种粘附，MBP能刺激PBMNC产生TNF，进一步证明MBP刺激的PBMNC培养上清可诱导VCAM-1的表达，促进ICAM-1表达数量提高。因而认为，MBP一方面通过刺激PBMNC产生TNF，使其诱导内皮细胞产生ICAM-1，VCAM-1等粘附分子^［5，6］，另一方面，MBP活化PBMNC，两方面共同促进PBMNC粘附到脑内皮细胞，进而进入脑内。

图4　免疫细胞化学方法检测HUVEC的VCAM-1的表达

　　Fig.4　The test of VCAM-1 expression on HUVEC by immunocytochemistry method

　　Note:A.normal control； B.culture with the supernatant of MBP stimulating PBMNC for 48 h；C.culture with TNF for 48 h； Arrow show positive cell

　　在实验的过程中发现，贴壁生长的HUVEC用常规的0.25%胰酶或胰酶加EDTA的方法消化，效果不好，消化下来的HUVEC经过离心洗涤后，易成碎片，不能保持完整的细胞形态，经多次实验后发现用4.4%的枸橼酸钠消化液，效果很好。

图5　FACS分析HUVEC表达的ICAM-1的数量的变化

　　Fig.5　The amount change of ICAM-1 expression on HUVEC by FACS analysis

　　Note:A.normal control；B.culture with the supernatant of MBP stimulating PBMNC for 48 h；C. culture with TNF for 48 h

　　PBMNC进入CNS除需ICAM-1和VCAM-1外，还可能需要其它粘附分子和趋化因子的参与，这方面的研究还有待于进一步进行。用抗粘附分子ICAM-1抗体和可溶性粘附分子sVCAM-1可在体外抑制PBMNC与内皮细胞的粘附，因而应用抗粘附分子ICAM-1抗体或sVCAM-1可望对中枢神经系统炎症时单个核细胞浸润产生缓解作用。

　　作者简介：刘红岩，32岁，女，讲师，博士研究生，主要研究神经免疫学

　　4　参考文献

　　［1］Eric A J，Ralph L N，Carl G B et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.J Clin Invest，1973;52:2745

　　［2］Vito G S，Walter N，Scott J B et al. Monocyte adhesion to end othelium in simian immunodeficiency virus-induced AIDS encephalitis is mediated by vascular cell adhesion molecules-1/α4β integrin interaction.Am J Pathol，1994;144(1):27

　　［3］Lobb R G，Chi-Rosso D，Leone Rosa M et al. Expression and functional characterization of a soluble form of vascular cell adhesion molecule 1.Biochem Biophy Res Com，1991;178(3):1498

　　［4］杨贵贞著.免疫生物工程纲要.长春：吉林科学技术出版社，1991：208

　　［5］Dobbie M S，Hurst R D，Klein N J et al. Upregulation of intercellular adhesion molecule-1 expression on human endothelial cells by tumor necrosis factor-alpha in an in vitrol:model of the blood-brain barrier. Brain Res，1999;830(2):330

　　［6］Mchale J F，Harari O A，Marshall D et al. Vascular endothelial cell expression of ICAM-1 and VCAM-1 at the onset of eliciting contact hypersensitivity in mice:evidence of a domain role of TNF-alpha.J Immunol，1999:162(3):1648

［收稿2000-01-10　修回2000-04-28］