点击显示 收起
人外周血NK细胞纯化方法的初步比较
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 免疫学技术与方法
作者：徐彤 田志刚 张彩 张建华 夏青 孙汭
单位：山东省医学科学院基础所山东肿瘤生物治疗研究中心，济南 250062
关键词: NK细胞；纯化；增殖；白细胞介素-2
摘 要 目的：初步探索NK细胞的纯化方法并在此基础上研究其生物学特性。方法： 分 别利用Panning法、补体裂解法、绵羊红细胞花环法对NK细胞进行纯化并利用流式细胞仪检 测其纯度，利用MTT法检测NK细胞对K562细胞的杀伤特性，利用RT-PCR检测NK细胞在IL-2 作 用下IFN-γ基因表达情况。结果：NK细胞的纯度由纯化前10％左右提高到55.75％，不同纯化 方法有所不同，纯化NK细胞较天然人PBMC对靶细胞K562的杀伤作用强，IL-2的促进作用更 为 明显，纯化NK 细胞较外周血单个核细胞（PBMC）有更强的体外增殖能力，NK细胞在IL-2 作用下IFN-γ基因表达提高。结论： 初步建立了人外周血NK细胞纯化及体外扩增的方法，纯 化NK细胞与人PBMC和LAK细胞相比具有独特的生物学特性。
中国图书分类号 R392.12
Preliminary study on the purification methods of human NK cells
XU Tong, TIAN Zhi-Gang, ZHANG Cai et al.
(Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062)
Abstract Objective: To study the biological characteristics of purified hum an NK cells.Methods: Human NK cells were purified from the peripheral blood by T cell panning, complement lysis and sheep red blood cell rosettes method (SRBC) . Compare the cytolytic activity, proliferation ability and IFN-γ mRNA expre ssi on of the purified NK cells and PBMC by MTT, cell counting and RT-PCR respectiv e ly.Results: NK cells were purified from 10% to 55.73% at most. The cytolytic ac tivity and proliferation ability of purified NK cells are stronger than those of PBMC. The expression of IFN-γ mRNA of the purified NK cells was enhanced whe n s timulated by IL-2.Conclusion: Purified NK cells have different biological char acteristics compared with PBMC or LAK cells.
Key words NK cells Purification Proliferation Interleukine-2
NK细胞是重要的淋巴细胞亚群，NK细胞可以从骨髓、胎肝、胎脾及脐血中获 得，但人成 熟NK细胞的主要来源是外周血。由于NK细胞仅占外周血单个核细胞的5～10％，因此NK细胞 的纯化及体外扩增是研究NK细胞重要的方法学基础。NK细胞不仅在不需要特异抗原的刺激 下即可杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，它的功能还受多种细胞因子的调节，其中IL-2在体 外可显著促进NK细胞的杀伤功能及增殖。本研究利用几种不同方法对NK细胞进行纯化并对纯 化NK细胞的生物学活性进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 培养液 RPMI1640（GIBCO，美国），用时配成含10％小牛血清（NCS ）、20 mmol/L HE PES、L-谷氨酰胺30 mg/ml、5×10-5 mol/L 2-巯基乙醇及常规量青、链霉素，下简称完全培养基。
1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液（上海荣盛生物试剂厂）、50 μg/ml CD 3单抗(本室纯化） 、50 μg/ml CD8单抗（本室纯化）、豚鼠血清补体（-70℃冻存）、羊抗鼠IgG 0.1 mg/ml 、 新鲜绵羊红细胞（SRBC）、rIL-2 10万U/ml (本室自产）、PHA 1 mg/ml (广州医工院）。
1.3 人外周血PBMC的分离 取不同健康人外周血白细胞，用淋巴细胞分离 液分离出单个核细胞，经无菌生理盐水洗涤2次后即成。
1.4 NK细胞的纯化
1.4.1 单抗铺皿（Panning）法分离纯化NK细胞 无菌平皿用羊抗鼠IgG 0.1 mg/ml 1 ml 包 被8 h，用含5％NCS的生理盐水洗3次。单个核细胞悬液离心计数，2×107 细胞中加入CD3单抗及CD8单抗各200 μl，放置4℃ 30 min，用含5％NCS的生理盐水洗3次后 以5％NC S的生理盐水悬浮细胞，调整细胞浓度为5×106 ml-1。将上述细胞悬液加入已包 被好的平皿中 4℃ 40 min，轻悬使细胞重新分布再放置4℃ 40 min。收集非粘附细胞计数并用流式细胞仪 （FACS）检测NK细胞表面标记CD56、CD16分子。
1.4.2 补体裂解法（CDC）纯化NK细胞 单个核细胞悬液离心计数，2×1 07细胞中加入CD 3单抗及CD8单抗各200 μl，放置4℃ 30 min，取出用含5％NCS的生理盐水洗3次，离心，加 入 冻存的豚鼠血清1 ml 37℃ 放置1 h，用淋巴细胞分离液分离去除其中的死细胞，用5％NCS 的生理盐水洗2遍，细胞计数并以FACS检测NK细胞表面标记CD56、CD16分子。
1.4.3 绵羊红细胞花环法（SRBC）分离纯化NK细胞 分离单个核细胞， 以完全1640调整细 胞浓度为4×106ml-1 ，以完全1640调整新鲜绵羊红细胞浓度为3×108ml- 1，取两者各5 ml并 加入5 ml NCS混匀，500 r/min离心5 min，29℃ 孵育1 h，轻轻摇起细胞沉淀，用淋巴细 胞 分离液分离，吸取淋巴细胞分离液与上层液面间的细胞，以生理盐水洗2遍，计数所获细胞 并用FACS检测NK细胞表面标记CD16、CD56分子。
1.4.4 联合应用Panning法和补体裂解法纯化NK细胞
1.5 台盼蓝计数活细胞 配制0.4%的台盼蓝溶液，调节其pH值至7.0～7 .2，按9:1混合细胞悬液和染液，4 min内计数，死细胞着色而活细胞不着色。
1.6 MTT检测NK细胞的杀伤活性
1.6.1 肿瘤靶细胞 为本室长期保存的NK敏感性肿瘤细胞K562，以完全 培养基培养。
1.6.2 效应细胞 设2个对照组。①纯化NK细胞与外周血单个核细胞,②1 000 U/ml rIL- 2活化4 d的NK细胞和LAK细胞。
1.6.3 上述细胞杀伤活性的MTT法检测 在96孔板上将效应细胞分别按不 同效/靶25:1、12.5 :1、6.25:1、3:1与靶细胞K562孵育48 h后加入MTT 10 μl/孔，4 h后离心弃上清，加5 0％无水乙醇和50％二甲基亚枫混合液200 μl/孔，充分吹打、混匀。读取A570 nm和A630 n m值，按下列公式计算杀伤率：
杀伤率%=〔1-(杀伤孔(A570-A630)-效应孔(A570-A 630)〕×100%。
靶细胞孔(A570-A630)
1.7 RT-PCR检测IL-2 1 000 U/ml 作用下NK细胞IFN-γ mRNA表达情况 采用GIT一步法 提取 细胞总RNA，M-MLV逆转录酶为GIBCO产品，逆转录反应及PCR反应利用本室已建立的反应体 系［1］。分别检测未活化及活化NK细胞IFN-γ mRNA表达情况。
2 结果
2.1 几种方法纯化NK细胞纯度及收获率的比较 在研究过程中分别利用补 体裂解法、T细胞 Panning、绵羊红细胞花环法、补体裂解法＋T细胞Panning法对不同来源外周血NK细胞进行 纯化，FACS（流式细胞仪）检测其纯度由12.92%提高到30%～55.73％不等，收获率约为4 5％ 以上，台盼蓝计数活细胞比例在85％以上，每一纯化方法均重复3～5次，表中所列为平均结 果（表1）。
2.2 不同外周血来源纯化后的NK细胞与PBMC对K562细胞杀伤活性比较 本 实验结果重复3次，图中显示为其中1次结果，结果重复性好。
2.2.1 比较不同效靶比值下未经IL-2活化的纯化NK细胞与PBMC对靶细胞 K562的杀伤率，发现纯化NK细胞的杀伤活性显著高于PBMC（图1）。
2.2.2 比较相同浓度IL-2（1 000 U/ml）作用下纯化NK细胞与PBMC（LA K细胞）对靶细胞K56 2的杀伤率，可以看出活化NK细胞的杀伤活性显著高于未纯化PBMC（LAK细胞），其中NK细胞 的杀伤率在效靶比为25:1时即可达到90％（图2）。
2.3 IL-2对不同来源人外周血纯化NK细胞与PBMC扩增的比较 相同浓度I L-2（1 000 U/ml） 对NK细胞与LAK细胞（PBMC）增殖反应作用的比较。体外培养3 w发现NK细胞在体外增殖速度 及增殖倍数均高于LAK细胞，此实验重复3次，结果重复性良好（图3）。
表1 不同方法纯化NK细胞所获细胞纯度及收获率的 比较
Tab.1 Results of the different methods to purify NK cell from peripheral blood
| Purify methods | Total cell number | Purity of NK cells
(CD56++CD16+)(%) |
Cells obtained after purification | Recorvery of NK cell s(%) |
| Panning | 4×107 | 30.18 | 1.1×107 | 69 |
| CDC | 4×107 | 47.25 | 8×106 | 78 |
| Panning+CDC | 4×107 | 55.73 | 4×106 | 48 |
| SRBC法 | 2×107 | 39.85 | 4×106 | 68 |
note:These methods have been repeated three times from different blood do nors.The result shows here is the average level of those experiments
| 图1 纯化NK细胞和PBMC对靶细胞K562的杀伤活性比较
Fig.1 Cytotoxicity of purified NK cell and PBMC |
图2 IL-2作用下纯化NK细胞和PBMC(LAK)对靶细胞K562的杀伤作用比较
Fig.2 Cytotoxicity of IL-2 activated NK cell and IL-2 activated PBMC(L AK)
图3 IL-2作用下纯化的NK细胞和PBM(LAK)增殖比较
Fig.3 Proliferation of IL-2 activated purified NK cell and IL-2 actriv ated pBMC(LAK)
图4 IL-2 1 000 U/ml刺激下纯化NK细胞与PBMC IFN -γ mRNA的表达(RT-PCR)
Fig.4 IFN-γ mRNA expression of purified NK cells and PBMC when stimula ted by IL-2
Note:This result has been repeated three times from different blood donor s
2.4 纯化NK细胞在IL-2的作用下可大量表达IFN-γ mRNA NK细胞在活 化条件下可产生大量 的细胞因子，其中的IFN-γ在体内的免疫反应中至关重要。RT-PCR结果证明IL-2的单独 作用即可促进NK细胞大量表达IFN-γ mRNA，与PBMC相比表达量增加（图4) 。
3 讨论
NK细胞作为机体防御体系的第一道屏障，其功能越来越受到人们的重视，由于NK细胞在 人外周血中数量远远少于T、B淋巴细胞，建立NK细胞纯化及体外扩增的方法成为进一步研究 NK细胞的重要方法学基础。尽管国外已经建立了多种NK细胞纯化的方法并获得高纯度NK细胞 ，如利用流式细胞仪或免疫磁珠法［2，3］，但其成本高，操作相对复杂等因素限制 了其在 国内的推广应用，本实验旨在利用相对简单的方法获得相对高纯度的NK细胞。在研究过程中 分别利用补体裂解法、T细胞Panning、绵羊红细胞花环法及以上3种方法的组合对外周血NK 细胞进行纯化，FACS检测其纯度由10％左右提高到近60％左右，收获率约为50％，台盼蓝计 数活细胞比例在85％以上，这些结果与国外报道相近。3种方法中绵羊红细胞花环法所获NK 细胞纯度相对较低，可能因为NK细胞表面存在低亲和力绵羊红细胞受体所致，因此应注意控 制其孵育温度在29℃。在补体裂解法和T细胞Panning中，由于受条件限制，没有加入CD4单 抗，可能对结果产生部分影响，另外实验中所用的豚鼠血清补体极易失活，在取血清时应注 意低温操作，以保证补体活性。从目前国内研究的情况来看，本实验所获NK细胞纯度可初步 满足对NK细胞生物学特征的研究，而且这些方法较易操作，成本也相对较低。
NK细胞可在无预先致敏时杀伤某些血液系统肿瘤和一些变异转化细胞，比较不同效靶 比值下未经IL-2活化的纯化NK细胞与PBMC对靶细胞K562的杀伤率，发现纯化NK细胞的杀伤 活性显著高于PBMC，进一步证明PBMC对K562细胞的杀伤是其中NK细胞所为，同时说明上述纯 化方法不损伤NK细胞的生物学活性。比较相同浓度IL-2（1000U/ml）作用下活化的纯化NK 细 胞与活化的PBMC（LAK细胞）对靶细胞K562的杀伤率可以看出纯化NK细胞的杀伤活性显著高 于LAK细胞，其中NK细胞的杀伤率在效靶比为25:1时即可达到90％，提示LAK细胞对靶细胞的 杀伤功能可能主要是通过NK细胞毒功能来实现的，其对IL-2的反应性更为敏感。 NK细胞不 仅具有强大的杀伤功能，而且具有更重要的免疫调节功能，NK细胞在活化条件下可分泌多种 细胞因子，其中的IFN-γ在体内的免疫反应中至关重要［4］。研究发现IL-2不仅 可促进NK细 胞的体外增殖及其杀伤功能，利用RT-PCR检测证明，IL-2的单独作用即可促进NK细胞大量 表 达IFN-γ mRNA，通过观察IFN-γ mRNA的表达也证实纯化NK细胞较PBMC表达量高，也提示 了NK细胞可能是外周血淋巴细胞中产生IFN-γ的主体。
国家自然科学基金资助项目（批准号39870729）
作者简介：徐 彤，女，26岁，硕士研究生，主要从事免疫学研究；通讯作者：田志刚，男，42岁，教授，博士生导师，主要从事 肿瘤免疫学研究
参考文献
1，刘 杰，田志刚，孙
2，Rabinowich H, Sedlmayr P,Herberman R B et al. Increased p roliferation lytic activity and purity of human natural killer cells cocultured with mitogen-activated feeder cells. Cell Immunol, 1991;135:454
3，Niemeyer C M, Siaff C A, Smith B R et al. Hematop oiesis in vitro coexists with natural killer lymphocytes. Blood, 1989; 74:2376
4，田志刚, 孙
［收稿1999-08-12 修回1999-12-20］