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慢性肾功能衰竭患者与HLA-DRB1等位基因相关性分析
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 遗传免疫学
作者：翟宁 耿龙 贺卫东 宋芳吉
单位：中国医科大学第一临床学院卫生部免疫皮肤病重点实验室，沈阳110001
关键词: 慢性肾功能衰竭(CRF)；聚合酶链反应——序列特异性引物(PCR-SSP)；HLA-DRB1等位基因
摘 要 目的：探讨东北地区汉族人HLA-DRB1等位基因与慢性肾功能 衰竭的遗传关联。方法：应用聚合酶链反应——序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术，对 44例慢性肾功能衰竭患者以及336例正常人HLA-DRB1等位基因进行分析。结果：慢性肾功能衰竭患者DRB1*0701的基因频率较正常对照组明显 增高，且有非常显著性差异(P＜0.001，RR=4.76，Pc＜0.01)；患者组的DRB1 *1201、12等位基因频率明显高于正常对照组，差异有显著性(P＜0.005，RR=6.8 3，Pc＜0.05)；结论：DRB1*0701和DRB1*1201/1202基因与慢性肾功能衰竭有一定 的关联，慢性肾功能衰竭患者与正常人之间存在着免疫遗传异质性的差异。或者可以提示携 带 DRB1*0701和RDB1*1201/1202基因肾病患者，预后较差，易发展成为不可逆的慢性肾功 能衰竭。
中国图书分类号 R692.5
The association of HLA-DRB1 alleles in patients with c hronic renal failure from northern Chinese
ZHAI Ning,GENG Long,HE Wei-Dong et al.
(Key Laboratory of Immun odermatology Ministry of Public Health,the No.1 Hospital,China Medical Universit y,Shen Yang 110001)
Abstract Objective:To further evaluate the nature of HLA -DRB1 allelos association with chronic renal failure(CRF) from northern Chinese .Methods:HLA-DRB1 typings of 44 patients with CRF and 336 control persons from northern Chinese were investigated by polymerase chain reac tion sequence-specific primer method,and the frequencies of DRB1 alleles were c ompared.Results:It was found that the patients with CRV ha d ve ry significantly increased frequencies of the HLA-DRB1*0701 gene (P＜0.0 1,RR= 4.76,Pc＜0.01),and DRB1*1201/1202 gene frequency of CRF patients group was higher than that of healthy group significantly(P＜0.005,RR=6.83,Pc＜0. 05).Conclusion:The results suggest that HLA-DRB1*0701 and D RB1*1201/1202 genes contribute to genetic sussceptibility to chronic renal fai lure.
Key words Chronic renal failure PCR-SSP HLA-DR B1 gene
慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)是由各种原因引起肾脏损害并进行性恶化 ，造 成肾单位严重毁损，使机体在排泄代谢废物和调节水、电解质及酸碱平衡等方面发生紊乱的 临床综合征。CRF病因尚不明确，现多认为是免疫发病机制，不仅涉及体液免疫、细胞免疫 和补体免疫，而且还有多种因子参与发病，为进一步探讨CRF的免疫遗传学发病机制，我 们对患有慢性肾功能衰竭的患者进行了HLA-DRB1基因的检测，以期探讨二者之间的联系， 现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 患者组为我院CRF患者44例，无血缘关系。其中男32例、 女12例，年龄19～54岁，所有病例均经临床检查证实为慢性肾功能衰竭；正常对照组为中国 东北地区无血缘关系汉族健康个体 336例，性别、年龄分布与患者组相当。
1.2 主要试剂及仪器 HLA-DRB1等位基因序列特异性引物是针对DRB1第 二外显子多态性设计的，为德国ESSEN大学合成，共23对，扩增产物均具有等位基因或等位 基因组的特异性。分型结果和血清学方法测得的HLA-DR表型具有对应关系，详见表1；TaqD NA聚合酶、10×PCR缓冲液及dNTP均为美国Promega公司产品；PE-480型PCR扩增仪为美国PE 公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取 采用快速盐析法提取。
1.3.2 DNA扩增 每个特异性反应体系为20 μl体积，包括引物、dNTP、 Taq酶、模板DNA。PCR反应条件为：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 45 s，退火65℃ 1 min， 延伸72℃1 min，共30个循环；后延伸72℃ 5 min。
1.3.3 结果判定 扩增产物于2%琼脂糖凝胶中(含溴化乙锭1 μg/ml)电 泳20 min。电泳后，在紫外透射灯下观察，在相应的DRB1等位基因泳道中可见到清晰的DNA 条带即为阳性。
1.3.4 统计分析 慢性肾功能衰竭与HLA-DRB1基因的相关性是通过相对 危险性RR(relative risk)及RR的显著性X2 检验来确定的。P值校正(即Pc值 )是按常规求得的P值乘以所比较的抗原(或基因)数。
2 结果
2.1 样品中有一对引物检出特异性DRB1*140x，即表示该引 物可检出具有DR14血清学特异性的等位基因组，包括DRB1*1401、1404、1405、1407、140 8；若某个体DRB1*140x为阳性，则该个体必携带上述基因组所含的5个等位基因之一，见 表1。同 样DRB1*150x(1501、1502)、160x(1601、1602)、040x(0401、0402)、080x(0801、0806) 、110x(1101、1105)、120x(1201、1202)等分别表示具有DR15、DR16、DR4、DR8、DR11、DR 12等血清学特异性的各个等位基因组。
2.2 慢性肾功能衰竭患者组与正常对照组HLA-DBB1等位基因频率比较结 果见表2。
由表2可见，慢性肾功能衰竭患者的DRB1*150x、0301/2、040x、0701、110x、120x和 140x等位基因频率均高于正常对照组的基因率(P＜0.05)，但经P值校正后，有显著性 差异的等位基因为DRB1*0701(P＜0.001，RR=4.76，Pc＜0.01)和DRB1*1201 /120 2(P＜0.005，RR=6.83，Pc＜0.05)。由表可见携有DRB1*0701和DRB1*1201/ 1202基因的慢性肾功能衰竭患者在比例上均高于携有其它型别的HLA基因者。
表1 HLA-DRB1等位基因序列特异性引物
Tab.1 Sequence-specific primes of HLA-DRB1 alleles
| HLA-DRB1 | serotype | pinmer | Position(bp) | ||
| 1 | 0101-0102 | (1) | 5’-01 | 3’-15 | 196 |
| 2 | 0103 | (1) | 5’-01 | 3’-10 | 197 |
| 3 | 1501-1502 | (2) | 5’-02 | 3’-01 | 197 |
| 4 | 1601-1602 | (3) | 5’-02 | 3’-02 | 213 |
| 5 | 0301-0302 | (3) | 5’-02 | 3’-03 | 151 |
| 6 | 0301 | (3) | 5’-06 | 3’-040 | 217 |
| 7 | 0302-1302-1305 | 5’-03 | 3’-047 | 189 | |
| 8 | 1402-1403-1409
0401-0414-1410 |
(4) | 5’-04 | 3’-040
3’-047 |
260 |
| 9 | 0701 | (7) | 5’-07 | 3’-079 | 232 |
| 10 | 0801-0806 | (8) | 5’-08 | 3’-05 | 214 |
| 11 | 0901 | (9) | 5’-09 | 3’-079 | 236 |
| 12 | 1001 | (10) | 5’-10 | 3’-047 | 204 |
| 13 | 1101-1105 | (5) | 5’-05 | 3’-05 | 167-176 |
| 14 | 1201-1202 | (5) | 5’-08 | 3’-08 | 248 |
| 15 | 1301-1304-1305 | (6) | 5’-08 | 3’-10 | 130 |
| 16 | 1303-1304-1305 | (6) | 5’-05 | 3’-045 | 171 |
| 17 | 1305 | (6) | 5’-03 | 3’-17 | 130 |
| 18 | 1401-1404-14051407-1408 | (6) | 5’-05
5’-08 |
3’-11 | 215 -224 |
| 19 | 1402-1305-13061406-1409 | (6) | 5’-03 | 3’-12 | 140 |
| 20 | 1410 | (6) | 5’-04 | 3’-19 | |
| 21 | RDB3* 0101-0301 | 5’-52.1
5’-52.2 |
3’-13
3’-14 |
17 2 | |
| 22 | DRB4* 0101 | 5’-53 | 3’-048 | 213 | |
| 23 | DRB5* 0101-0202 | 5’-51 | 3’-01
3’-16 |
200 | |
表2 慢性肾功能衰竭患者组和正常对照组DRB1等位基 因频率
Tab.2 Frequency of DRB1 alleles in CRF patients and normal people
| DRB1 | Normal group(n=336) | CRF group(n=44) | RR | X2 | P | Pc | ||
| Positive | GF1) | Positive | GF | |||||
| 0101/4 | 16 | 0.048 | 4 | 0.091 | 2.00 | 3.06 | NS2) | NS |
| 150x | 55 | 0.164 | 13 | 0.295 | 2.14 | 4.85 | ＜0.05 | |
| 160x | 12 | 0.036 | 4 | 0.091 | 2.70 | 3.38 | NS | NS |
| 0301/2 | 27 | 0.080 | 9 | 0.204 | 2.94 | 7.28 | ＜0.01 | NS |
| 040x | 46 | 0.137 | 11 | 0.250 | 2.10 | 4.23 | ＜0.05 | NS |
| 0701 | 15 | 0.047 | 8 | 0.182 | 4.76 | 12.10 | ＜0.001 | ＜0.01 |
| 080x | 27 | 0.080 | 3 | 0.068 | 0.83 | 8.64×10-3 | NS | NS |
| 0901 | 47 | 0.140 | 6 | 0.136 | 0.97 | 4.23×10-3 | NS | NS |
| 1001 | 14 | 0.042 | 3 | 0.068 | 1.68 | 1.15 | NS | NS |
| 110x | 23 | 0.068 | 7 | 0.159 | 2.57 | 4.91 | ＜0.05 | NS |
| 120x | 20 | 0.060 | 8 | 0.182 | 3.51 | 8.56 | ＜0.005 | ＜0.05 |
| 130x | 26 | 0.077 | 1 | 0.023 | 0.30 | 1.23 | NS | NS |
| 140x | 18 | 0.054 | 6 | 0.136 | 2.79 | 5.07 | ＜0.05 | NS |
note:1)GF is frequency of gene，2) NS is no significant difference3 讨论
慢性肾功能衰竭(CRF)的病因很多。各种原发性的或继发的肾脏疾患，如病变持续进展，均 可使肾实质受到破坏，进而导致慢性肾功能衰竭。调查发现，多种原发肾小球的发病与种 族 和地区有关，也发现同一家族中有多个成员发病，因此推断肾脏疾病的发病机制与遗传因素 有 关。自1969年Paterl等首次报道肾小球肾炎与HLA的关系之后，已初步证明HLA在肾脏疾病的 发生、发展及预后中起一定的作用。
陈香美等利用与HLA-DRB1基因互补的寡核苷酸探针检测了北方汉族正常人及非IgA系膜增殖 性肾炎基因频率分布，结果发现以肾病综合征为临床表现的非IgA系膜增殖性肾炎基因频率 是以DR12(5)增高为特征［1］，可以认为非IgA系膜增殖性肾炎是由于易感基因或致 病因子与HLA-DR特异性等位基因密切连锁导致的。周国平等发现HLA-DRB1*07与上海地 区激素敏感型肾病综合征有关［2］，DRB1*09与该病的频繁复发有关。古原雅树 认为患者组中，HLA-DR4较正常人的基因频率高，DR2则较正常人的基因频率低［3］；而贾保祥等的研究结果显示，携有HLA-DR1、DR12和DR14抗原的患者均显著高于正常人群 ，特别是DR12抗原在患者中出现的频率比较高，与正常人有非常显著性差异［4］。 由此可见，在国内有关CRF与HLA-DRB1等位基因关联的研究并不多见。
本文的结果显示，经校正P值后(即Pc值)，有显著性差异的等位基因为DRB1*0701 (P＜0.001，RR=4.76，Pc＜0.01)和DRB1*1201/1202(P＜0.005，RR=6. 83，Pc＜0.05)。特别是DRB1*0701等位基因，其基因频率较正常人增高，且有非常 显著性差异。说明DRB1*0701和DRB1*1201/1202等位基因与慢性肾功能衰竭的发病有密 切的关联，慢性肾功能衰竭患者与正常人之间存在着免疫遗传异性的差异；也或者可以提 示携带DRB1*0701和DRB1*1201/1202基因的肾病患者，预后较差，易发展成不可逆的慢 性肾功能衰竭。同其它研究相比，慢性肾功能衰竭与HLA之间的关系结果不完全相同，说明C FR的易感性、预后可能与人种、民族、地域等因素有关。
作者简介：翟 宁，女，37岁，实验师，从事临床免疫学实验工作
参考文献
1，陈香美，柏立群，周柱亮et al.以肾病综合征为表现的非IgA系膜 增殖性肾炎HLA-DR基因频率分布.中华肾脏病杂志，1995；11(2)：100
2，周国平，郭怡清，张雁征et al.肾病综合征患儿HLA-DRB1基因分型.中华肾脏病杂 志，1995；11(6)：347
3，Kashiwabara H,Shishido H,Yokoyama T et al.HLA in IgA nephropathy.Tissue A ntigens,1980;18:411
4，贾保祥，李哲先，张玉梅et al.慢性肾小球肾炎尿毒症患者HLA抗原的表达.中华微 生物学和免疫学杂志，1998；18(1)：41
［收稿1999-10-21 修回2000-05-10］