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湖北汉族人群对乙肝疫苗免疫应答能力与HLA-DRB1等位基因相关性的研究
免疫学杂志 2000年第1期第16卷 临床免疫学
作者：涂正坤 吴雄文 刘敏 姜晓丹 杨志章 吴锋 龚非力 赵修竹
单位：涂正坤（广州市妇婴医院医学遗传研究所，广东 广州 510180)； 吴雄文(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）； 刘敏(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）； 姜晓丹(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）； 杨志章(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）； 吴锋(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）； 龚非力(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）； 赵修竹(同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030）
关键词：HLA-DRB1；乙肝疫苗；免疫应答
摘 要：目的 分析HLA-DRB1等位基因型别与个体乙肝疫苗免疫应答水平的相关性。方法 对37名湖北汉族健康自愿者进行HBV血源型疫苗标准全程接种，共3次（0，1，6月），末次接种后8周用酶免疫法（EIA）检测血清抗-HBs抗体水平（S／N≥2．1为应答者，S／N＜2．1为无应答者）；同时，对全部受试者进行HLA-DRB1基因分型。结果 37名个体中无应答者7名（19％），应答者30名（81％），无应答与HLA-DRB1001等位基因具有显著相关性，RR＝21．75，X2＝5．55，P＜0．05。结论 在湖北汉族人群中，携带HLA-DRB1001等位基因个体对乙肝疫苗的免疫应答水平明显低于其他个体。
中图分类号：R392.11；R394.5；R311.144；R730.3 文献标识码：A
Association between the feature of the immune response to hepatitis B vaccine and HLA-DRB1 alleles in a Hubei population of the Han nationality
TU Zheng-kun
(Institute of Medical Genetic，Woman-Baby Hospital，Guangzhou 510180，China)
WU Xiong-wen LIU Min JIANG Xiao-dan YANG Zhi-zhang WU Feng
GONG Fei-li ZHAO Xiu-zhu
(Department of Immunology，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China）
Abstract：Objective The aim of the present work is to study the association between HAL-DRB1 alleles and the feature of the immune response to hepatitis B vaccine among different individuals．Methods 37 health volunteers from Hubei of the Han nationality were subjected to a standard course of immunization with HBV plasma vaccine at month 0，1 and 6，successively，8 weeks after the last immunization，the serum level of anti-HBs antibody was examined with EIA．Individuals with S／N≥2．1 were rated as responders，while those with S／N＜2．1 were nonresponders．Results 30（81％）of the 37 subjects were responders，and only 7（19％） were nonresponders．Unrespon-siveness of these 7 individuals to hepatitis B vaccine were found to be closely associated with HLA-DRB1001 allele，（RR＝21．75，X2＝5．55，P＜0．01），as assayed with the PCR-SSP typing．Conclusion The level of immune response to hepatitis B vaccine of individual bearing HLA-DRB1001 allele is significantly lower than others．
Key words：HLA-DRB1；hepatits B vaccine；immune response▲
在哺乳动物中，主要组织相容性复合体（MHC）是位于某一染色体上的一组紧密连锁的基因群，它控制机体对抗原的免疫应答和对疾病的易感性。主要在小鼠进行的动物实验已证实，在MHC复合体中存在着控制免疫应答的基因（Ir gene），后者可能定位于MHC-Ⅱ类基因区［1，2］。但在人类，由于难以获得性状稳定的简单抗原，无法通过接种而准确判断受试者的应答水平，故严重影响了对Ir基因的研究。近年来，乙肝疫苗的问世不仅为乙型肝炎的预防提供了有力的武器，而且为研究人类免疫应答的遗传控制提供了一个工具。
本室长期从事有关HLA多态性与疾病关联的研究，并在此基础上进一步研究HLA复合体结构和功能的关系。本实验通过对湖北汉族人群进行乙肝疫苗的标准全程接种，分析中国汉族人群对乙肝疫苗的免疫应答水平及其与HLA遗传多态性的关系，进而探讨HLA对个体乙肝疫苗应答水平的调控作用及其机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料 HLA-DRB1等位基因序列特异性引物（SSP）（德国Essen大学Grosse-Wilde教授惠赠）；Taq酶、蛋白酶、dNTP、琼脂糖（德国Boehringer Mannheim公司）；RPMI1640（美国Gibco公司）；加热灭活血源型乙肝疫苗（卫生部武汉生物制品研究所）；抗-HBs（EIA）酶免疫法试剂盒（上海实业科华生物技术有限公司）。
1.2 研究对象 37名健康自愿受试者均为湖北省鄂州市汀祖镇王边村居民（10～40岁之间；男性16名、女性19名），对受试者进行乙肝疫苗标准全程接种（0、1、6月肌肉注射），在全程接种后8周采集外周静脉血标本。
1.3 方法
1.3.1 HLA-DRB1基因分型：HLA-DRB1基因分型采用本室参考国外文献所建立的PCR／SSP方法，主要步骤如下。
1.3.1.1 基因组DNA的提取：采用经典的盐析法；
1.3.1.2 HLA-DRB1等位基因特异性片段的扩增：①配制5×buffer-C［300mmol Tris、7．5mmol（NH4）2SO4、12．5mmol MgCL2 pH8．5］；引物混合液［2pmol 5＇末端和3＇末端引物（HLA-DRB1*）、1×buffer-C、Ficoll 400（终浓度1.0％ V／V）］等，每一PCR管中含如下反应成分：引物混合液17μl、模板DNA 60～100ng、Taq酶0．5u、dNTP 1．25mmol。充分混合后在液面上加石蜡油20μl。②PCR反应：应用Perkin Elmer TC1型扩增仪进行PCR反应，预变性94°C 5min后，选择如下的循环参数：94°C 1min、65°C 1min、72°C 1min共30个循环。
1.3.1.3 特异性扩增产物的检测：用1×TBE配制2％琼脂糖凝胶，加EB（1μg／ml），电泳条件为电压10～15V／cm凝胶，时间20min，电泳完毕后在紫外透射仪下观察结果，阳性反应者可在相应的泳道见到明显的DNA扩增产物条带。
1.3.2 抗HBs抗体水平测定：取受试者血清，借助酶免疫法（ELA）检测抗-HBs抗体水平。简言之，加入待测标本于包被HBsAg的反应板中，设抗-HBs抗体阴性对照和阳性对照各2孔，空白对照1孔，然后加酶结合物，充分混匀，孵育37°C 1h，洗涤后加底物液置37°C孵育15min，然后加终止液。用酶联检测仪测定OD492nm值，按下列公式计算并判断结果：样品OD值／阴性对照平均OD值，比值≥2．1为阳性。
由于多种因素可能影响EIA检测结果，为避免实验操作而致的误差，对每份样本连续检测3次，取平均OD值判断结果。S／N≥2．1为应答者，S／N＜2．1为无应答者。
1.4 统计处理 相对危险性（relative risk，RR）计算按Woolf公式：RR＝ad／bc。其中a为无应答者携带某一特定HLA型别的人数，d为应答者不携带某一特定HLA型别的人数，b为无应答者不携带某一特定HLA型别的人数，c为应答者携带某一特定HLA型别的人数。四格表卡方检验按下列公式：
如1＜T＜5、N＞40，则采用校正公式：
2 结果
37名受试者HLA-DRB1分型结果和抗-HBs抗体水平见表1。在37名个体中无应答者7名（19％），应答者30名（81％）。HLA-DRB1等位基因与乙肝疫苗免疫应答的关联见表2。7名无应答者中携带HLA-DRB1001者3人（42.8％），明显高于应答者（30人）携带HLA-DRB1001者1人（3.3％），X2＝5.55，P＜0.05，RR＝21.75。
表1 湖北汉族人群37名个体HLA-DRB1型别和抗-HBs抗体水平
Tab1 HLA-DRB1 allel and level of anti-HBs antibody in 37 individuals of Hubei Han nationality
| Specimen ID | HAL-DRB1 | Level of anti-HBs | |
| OD | S／N | ||
| D409 | DRB*070X104X | 0.49 | 5.76 |
| *D410 | DRB*070X1001 | 0.13 | 1.52 |
| D411 | DRB*070X040X | 3.00 | 35.29 |
| D412 | DRB*0301 150X | 1.60 | 18.82 |
| *D413 | DRB*080X | 0.14 | 1.64 |
| D414 | DRB*080X0901 | 2.21 | 26.00 |
| D417 | DRB*0301 | 0.18 | 2.11 |
| *D418 | DRB*120X0301 | 0.09 | 1.05 |
| D419 | DRB*0901 | 2.73 | 32.11 |
| D420 | DRB*040X | 2.36 | 27.76 |
| D421 | DRB*070X040X | 3.32 | 39.05 |
| *D422 | DRB*0901 070X | 0.15 | 1.76 |
| D423 | DRB*040X110X | 0.44 | 5.17 |
| D424 | DRB*070X | 1.21 | 14.23 |
| D425 | DRB*080X0901 | 0.19 | 2.23 |
| D426 | DRB*080X | 3.32 | 39.05 |
| D427 | DRB*150X0901 | 1.22 | 14.35 |
| D428 | DRB*120X0301 | 0.42 | 4.96 |
| D429 | DRB*120X | 0.78 | 9.17 |
| D430 | DRB*160X070X | 1.46 | 17.17 |
| D431 | DRB*070X110X | 3.32 | 39.05 |
| *D432 | DRB*150X1001 | 0.11 | 1.29 |
| D433 | DRB*080X040X | 3.32 | 39.05 |
| D434 | DRB*150X120X | 3.20 | 37.64 |
| D435 | DRB*070X | 2.19 | 25.76 |
| D436 | D4B*120X | 2.58 | 30.35 |
| *D437 | DRB*150X1001 | 0.16 | 1.88 |
| D438 | DRB*070X0901 | 0901 | 2.69 |
| D439 | DRB*070X1001 | 3.32 | 39.05 |
| *D441 | DRB*080X120X | 0.13 | 1.52 |
| D442 | DRB*0901 120X | 1.37 | 16.11 |
| D443 | DRB*080X | 0.19 | 2.23 |
| D444 | DRB*120X070X | 0.28 | 3.29 |
| D446 | DRB*160X070X | 2.47 | 29.05 |
| D447 | DRB*0901120X | 1.78 | 20.94 |
| D548 | DRB*0．40X0901 | 2.84 | 33.41 |
| D549 | DRB*070X0901 | 1.07 | 12.58 |
*Nonresponder，ie anti-HBs S／N＜2．1
表2 乙肝疫苗应答者和无应答者HLA-DRB1基因频率的比较
Tab 2 Comparision of HLA-DRB1 allel frequencies in res-ponders and nonresponders to hepatitis B vaccine
| HLA-DRB1 | Nonresponder | Responder | P |
| DRB*1001 | 3 | 1 | ＜0.05 |
| DRB*070X | 3 | 12 | N.S |
| DRB*080X | 2 | 5 | N.S |
| DRB*150X | 2 | 3 | N.S |
| DRB*120X | 2 | 7 | N.S |
| DRB*0301 | 1 | 3 | N.S |
N．S：not significant
3 讨论
作者曾对湖北汉族人群中乙肝疫苗应答水平与HLA-Ⅰ类分子多态性的关联进行研究，发现人群中对乙肝疫苗无应答者与HAL-B39显著相关（RR值为5．22），而与HLA-B62呈负相关［3］。本实验乃前述工作的继续，进一步在DNA水平上探讨人群对乙肝疫苗的免疫应答与HLA-DRB1等位基因遗传多态性的关系。
本实验结果发现：携带HLA-DRB11001的个体对乙肝疫苗无应答率极高。在全部受试者中，无应答（7名）而携带HLA-DRB11001的个体占2名（28％），明显高于有应答（32名）而携带HLA-DRB11001的者1名（3％）。实验结果还发现，携带单体型HLA-B39-DRB11001的2名个体均为无应答者，而且均为杂合子。但是，由于本课题的样本数较少，尚难以确定该单体型即为中国汉族人群对乙肝疫苗无反应性的特征性单体型。
WALKER等［4］在1981年首先观察到高加索人种对乙肝疫苗低或无应答人群中，HLA-DR7频率极高，几乎无携带HLA-DR1表型者，据此推测与MHC关联的免疫应答基因可能控制人类对乙肝疫苗的免疫应答。其后，其他学者也报道［5］，在白种人群中，不仅携带HLA-DR7表型而且携带DR3表型者无应答率极高。资料表明：HLA-DR3、DR7表型者无应答率的增高是由于HLA-B8-SCO1-DR3、HLA-B44-FC31-DR7两种扩展单体型无应答率增高，而且均为纯合子，故推测人群对乙肝疫苗无应答是受MHC控制的隐性遗传，应答则为显性遗传。但是WATANABE等［6，7］在日本人群中发现：乙肝疫苗无应答者与DR4和DRW53表型具有极强的相关性。进一步研究认为［8］，扩展单体型HLA-BW54（REG-C4） RFLP（6．5kb＋12．0kb）-DR4-DRW53-DQW4（DQA10301-DQB10401）以显性遗传方式控制人群对乙肝疫苗的无反应性，因为携带这种单体型纯合子和杂合子的个体均为无应答者。
上述结果与本实验结果不同，可能与人种差异、接种方式以及接种后对受试者的管理等有关。
人类对乙肝疫苗无反应性的机理尚未完全清楚，主要有以下几种观点：
①是由于抗原提呈功能缺陷所致，表现为原抗提呈细胞（APC）不能有效地摄取、处理HBsAg，导致不能产生有效的免疫显位肽；或由于不同型别MHC-Ⅱ类分子槽状结构的差异，使之不能与免疫显位肽稳定结合，从而影响CD4＋T细胞的活化，表现为携带特定MHC单体型的个体无应答。
②是由于HBsAg特异性T细胞数量的下降。其原因可能是：T细胞在胸腺发育过程中所经历的选择过程出现异常，以至对HBsAg应答的特异性T细胞与自身反应性T细胞同时被清除；
③HBsAg特异的抑制性T细胞参与介导机体对乙肝疫苗的无反应性。
本课题研究所获结果有助于进一步探讨人类免疫应答的遗传控制机理，并可能为提高人群接种乙肝疫苗的免疫效果提供新的线索。■
作者简介：涂正坤（1966-），男，主治医师，硕士，主要从事免疫遗传学方面的研究。
参考文献：
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收稿日期：1999-02-26
修回日期：1999-07-27