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抗心磷脂抗体检测及其影响因素的研究
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 免疫学技术与方法
作者：裴瑾 米东辉 曲立科 杨翰仪
单位：裴瑾 曲立科 杨翰仪(白求恩医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室，长春130021)；米东辉(白求恩医科大学第三临床学院呼吸内科，长春 130041)
关键词: 抗心磷脂抗体；酶联免疫吸附测定法；系统性红斑狼疮
摘 要 目的：研究血清样品稀释度、温度、离子强度以及样品检测间 隔时间对血清抗心磷脂抗体(ACA)检测结果的影响。方法：采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测ACA。结果：血清样品最佳稀释度为1∶50；37℃时光吸收值比22℃和25 ℃的光吸收值显著下降；15 mol/L NaCl可明显抑制ACA与抗原结合(P＜0.01)，抑制率 平均为45.4%；包被14 d以上的检测结果明显高于1 d和7 d的测定结果(P＜0.05)。结论：血清ACA检测结果受血清样品稀释度、温度、离子强度及包被时 间影响。
中国图书分类号 R392.11
Studies on affected factors about antipholipid antibod ies determinations
PEI Jin,MI Dong-Hui,Qu Li-Ke et al.
(Basic College of Norman Bethune University of Medical Science,Changchun 130021)
Abstract Objective:Human sera ACA was detected by ELISA m ethod and some factors including the dilution rate of sera, blocking materials, te mperature,ionic strength and interval time between blocking and detection,which could probablly influence the detective level of sera ACA were investigated.[ WT5”HZ〗Methods:Human sera ACA was detected by ELISA.Results:10% NBS/PBS was more feasible than 1% bovine albu m in/PBS for blocking non-specific binding;the ACA titer of the same sample detec ted at 37℃ was lower than that of 22℃ and 25℃,the dilution rate 1∶50 for ser a was suitable for the detection; time internal between blocking and detection c ou ld influence ACA level when it exceeding 2 weeks;the blinding ability of Ag with Ab was signicantly inhibited when the NaCl inonic strength was higher than 1.5 mol/L.Conclusion:The detected results of human sera ACA influen c ed by the dilution rate of sera,blocking materials,temperature ionic strength a nd internal time between blocking and detection.
Key words ACA ELISA SLE
1983年Harris等应用放射免疫法测定SLE患者血清的ACA水平，该法具有较高的 敏感性［1］。以后经Loizou等改良得出与放射免疫法效果相同而更为方 便的酶联免 疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法［2］。由于ELISA具有 高度敏感性 、可定量、可检测抗体类及亚类、易于标准化、快速简便等优点，目前已成为定量测定ACA 的标准方法［3］。尽管ACA的ELISA检测方法已经确立，但是不同的实验室所测得的 结果存在着一定的差异［4］。本实验在建立了用以检测抗心磷脂抗体的IgG、IgM、I gA三个亚类的ELISA法的基础上，对影响ACA检测结果的血清稀释度、温度等因素进行了深入 的研究，旨在使此检测系统更加完善，为进一步提高其灵敏度和准确性提供客观的实验室依 据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 96孔聚苯乙烯板(简称微孔板，Pharmacia)，孵 育箱(日本Fuji公司)；酶标 测读仪(北京新技术应用研究所)；硅胶G(上海化学试剂厂)，心磷脂(自提)，辣根过氧化物 酶(HRP)标记的羊抗人IgG、IgM、IgA(北京军事医学科学院)，其它试剂皆为分析纯。
1.2 检测对象 10份异常SLE血清及10份正常健康人血清。
1.3 ACA的ELISA检测 参照文献［2，5］并加以改进。纯化的心磷 脂以无水乙醇稀释至50 μg/ml，用30 μg/孔包被微孔板，4℃无盖过夜蒸发干燥。用0.01 mo l/L、pH7.3的PBS常规洗板，然后每孔用110 μl、10%新生小牛血清(NBS)/0.01 mol/L PB S封 闭。每孔加100 μl用封闭液1∶50稀释的待测血清，每份样本均做2复孔，每块板均设空白 、 阴性、阳性及参考血清对照；37℃孵育3 h，洗板。用封闭液分别稀释HRP标记的羊抗人IgG( 1∶1 000)、IgM(1∶800)及IgA(1∶500)，每孔加100 μl，37℃孵育1 h，洗板。每孔加100 μl 邻苯二胺-H2O21底物溶液，37℃孵育20 min。每孔加50 μl、2 mol/L硫酸终止反应 。在492 nm波长下测光吸收(A)值。
1.4 血清样品稀释度对ACA测定结果的影响 血清样品(10份异常SLE样品 及10例随机选取的健康成人样品)分别按25倍、50倍、100倍、200倍及400倍稀释后，进行I gG-ACA测定。测定方法同1.3。
1.5 温度对ACA检测的影响 血清样品(10份异常SLE样品及10例随机选取 的健康成人样品)按50倍稀释，分别在22℃、25℃和37℃进行IgG、IgM、IgA-ACA测定。测 定方法同1.3。
1.6 离子强度对ACA测定结果的影响 分别用含有0.03、0.15、0.50 及1.50 mol/L NaCl的PBS按50倍的比例稀释10份异常SLE样品，进行IgG-ACA测 定。测定方法同1.3。
1.7 酶标板包被与检测间隔时间对样品ACA测定结果的影响 酶标板包被 后，4℃静置24 h后分成5组，其中1组进行IgG-ACA的检测，其余4组-20℃保存，并分别 于包被后的第7、14、30和60天进行IgG-ACA的检测。本实验以10例异常的SLE患者及随机抽 取的10例正常人血清样本为检测对象。
2 结果
2.1 血清样品稀释度对ACA检测的影响 通过对10份异常SLE血清及随机选 取的10份正常健康人血清按不同倍数逐级稀释，分别进行IgG-ACA的检测，从倍比稀释曲线 图(图1)可见随稀释倍数增大，光密度值逐步降低。在曲线中点处A值为0.65，此时血清稀 释倍数约为1∶50。
表1 温度对IgG、IgM and IgA-ACA检测结果的影响
Tab.1 Results for IgG、IgM and IgA-ACA levels determined at different t emperatures
|
Isotype |
SLE(n) |
Absorbance (492 nm) | ||
| 22℃ | 25℃ | 37℃ | ||
| IgG | 10 | 0.91±0.021) | 0.96±0.031) | 0.61±0.01 |
| IgM | 10 | 0.45±0.05 | 0.43±0.04 | 0.38±0.01 |
| IgA | 10 | 0.24±0.02 | 0.22±0.02 | 0.19±0.02 |
note:1)vs 37℃，P＜0.05
表2 CL包被板与样品检测间隔时间对实验结果的影响
Tab.2 Results for IgG-ACA levels of the same sera sample determined at different time
|
Subject |
n |
ACA levels (49 nm) | |||||
| 1 d | 7 d | 14 d | 30 d | 60 d | |||
| Normal | 10 | 0.25±0.02 | 0.25±0.07 | 0.26±0.05 | 0.25±0.02 | 0.25±0.01 | |
| SLE | 10 | 0.67±0.02 | 0.69±0.03 | 0.75±0.061) | 0.86±0.0 12) | 0.91±0.072) | |
note:1) vs 1 d,P＜0.05;2) vs 1 d,P＜0.01
2.2 温度对ACA检测结果的影响 1∶50稀释度的阳性血清分别于22℃、25 ℃和37℃下进行ELISA测 定。结果表明，22℃和25℃时测得结果较37℃时高，37℃时所得A值 显著下降。实验温度对IgG检验结果的影响大于IgM、IgA。
2.3 离子强度对ACA检测结果的影响 本实验用含0.03、0.15、0.50及 1 .50 mol/L NaCl的PBS稀释10份异常SLE血清，再进行IgG-ACA检测。结果0.03与0 .1 5 mol/L NaCl对ACA的测定值无显著影响。0.50 mol/L条件下A值有降低的趋势，但无统计 学意 义，而1.50 mol/L的NaCl可明显抑制ACA与抗原结合(P＜0.01)，抑制率平均为45.4%，见图2。
图1 血清样品稀释度对ACA检测结果的影响
Fig.1 Antibody response curves for IgG-ACA levels by dilution of sera s ample
图2 离子强度对ACA与抗原结合的影响
Fig.2 Results for IgG-ACA levels of sera samples diluted with different ionic strength buffers
图3 CL包被板与样品检测间隔时间对实验结果的影响
Fig.3 With time lapse of CL-coated plates exposed to air went on,sera f rom abnormal SLE group exhibited marked increases in ACA level
2.4 CL包被酶标板与样品检测间隔时间对实验结 果的影响 包被和测定 时间的长短对正常组的测定值无明显影响(P＞0.05)；对于异常组，包被后7 d测定与1 d测 定所得结果无统计学差异；14 d测定值较24 h测定值有明显提高；在30 d和60 d的测定值 与1 d测定值的差异更加显著(P＜0.01)；14 d与30 d与60 d测定值的差异无统计学 意义(见表2，图3)。
3 讨论
3.1 据文献［6］报道和本实验证实，ACA的ELISA检测中，不同温 度下的实验结果不同。这可能是由于温度升高使磷脂由极性片状结构转变成六边形H II型结 构 ，而后者与ACA亲和力低。血清中的糖蛋白协同因子(β2-GPI)能与负电荷磷脂结合，是A CA与CL结合所必需的。因NBS中含有β2-GPI，故10%NBS的封闭效果比1%BSA好，尤其是能 更好地阻断正常人血清的非特异性结合。
3.2 Kouts等报告了通过改变稀释血清样品的缓冲液的离子强度，可以影 响A CA与CL及β2-GPT的结合［7］。我们的实验结果进一步证实了这一点。提示ACA与 抗原间有借静电引力而结合的关系。
3.3 包被酶标板与样品检测间隔对实验结果产生差异的原因是由于CL含有 的 不饱和脂肪酸成分易于发生氧化，氧化产物本身或与蛋白质、蛋白多糖交联形成的复合物有 一定的免疫原性［7，8］。本实验中，虽在密闭条件下保存和吸取CL原液(溶于甲醇) ， 可防止CL与空气接触发生氧化而变性。但是，参照标准的ACA检测方案，CL包被后并未隔绝 空气，随后保存过程中也可与空气接触。可能会使CL发生氧化而具免疫原性。这就是提示SL E患者体内异常增高的ACA可能是针对血管内皮细胞、游离血细胞或体液内脂蛋白体发生氧 化 修饰的磷脂成分。本组实验所显示的健康人群与异常SLE患者血清ACA对氧化的CL识别能力 的 差异揭示了两组ACA产生的机制与病理生理学意义的不同。关于CL氧化所致理化性质同生物 学功能的改变和以此为依据对APS、SLE患者治疗方案的改进仍待进一步研究。
3.4 在不同的ELISA检测系统中存在着很多差异，其中包括封闭试 剂的不 同，病人样本的冻融状态不同，稀释度不同，缓冲系统离子强度不同，心磷脂来源的不同， 心磷脂包被方法的不同 等等，都会对实验结果产生影响，本实验在严格按照国际标准建立ACA的ELISA检测系统的同时，对其影响因素及其成因做了一定的探讨，从而为APS诊断提供了重复性好，敏感性高，特异性强，简便易行的ACA检测方法。
国家自然科学基金资助项目(39570317)
作者简介：裴 瑾，女，35岁，博士，副教授，主要研究生殖免疫
参考文献
1，Harris E N,Charavi A E,Boey M I et al.Anticardiolipin ant ibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus.Lancet,1983;2:1211
2，Loizou S, MeCrea J D,Rudge A C et al.Measurement of anticardiolipin ant ibodies by an enzyme linked immunosorbent assay(ELISA):standardization and quant itation of results.Clin Exp Immunol,1985;62:738
3，Sontheimer R D.Anticardiolipin syndrome,a new way to slice an old pie or a new pie to slice? Arch Dermatol,1987;123:590
4，Douglas A Triplett.Antiphospholipid-protein antibodies:Laboratory detectio n and clinical relevance.Thrombosis Research,1995;78:1
5，Munther A,Khamashta,Graham R V Hughes.Measurement of anticardiolipin an tibodies.Laboratory Methods in Immunology,1990;1:2252
6，Lockshin M D,Qamar T,Levy R A et al. IgG but not IgM antiphospholipid a ntibody binding is temperature dependent.J Clin Immunol,1988;8:188
7，Kouts S,Wang M X,Adelstein S et al. Immunization of a rabbit with β2 -glycoprotein I induces charge-dependent cross reactive antibodies that bind a nionic phospholipids and have similar reactivity as autoimmune anti-phospholipi d antibodies.J Immunol,1995;155:958
8，Horkko S,Miller E,Dudl E et al. Antiphospholipid antibodies are direct e d against epitopes of oxidized phospholipids.Recognition of cardiolipin by monoc lonal antibodies to epitops of oxidized low density lipoprotein.J Clinic Invest, 1996;98:815
［收稿1998-11-30 修回2000-05-26］