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干扰素对HL-60细胞与维甲酸耐药HL-60细胞作用的研究
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：姜国胜 唐天华 张玉昆 葛林阜 董强 任海全 姜枫勤 任青华 赵良玉
单位：山东省医学科学院基础所血液肿瘤研究室，济南250062
关键词: 干扰素；HL-60细胞；耐药
摘 要 目的：探讨干扰素α对HL-60细胞增殖分 化与凋亡的作用及 特点。方法：MTT法测定细胞增殖性变化。NBT方法测定细胞分化程度。流式 细胞仪测定凋亡的发生程度。浓度递增法诱导HL-60细胞的维甲酸耐药性。结果：IFNα体外抑制HL-6 0细胞增殖，并与维甲酸产生协同抑制作用。IFNα可单独诱导HL-60细胞分化，又能增加 维甲酸诱导分化作用。单独IFNα无明显的诱导HL-60细胞凋亡作用。维甲酸耐药HL-60细 胞 经IFNα作用3 d后，可明显恢复其对维甲酸的反应性。结论： IFNα既能促进 维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用，又可逆转HL-60的维甲酸耐药性。
中国图书分类号 R733.71
Study of IFNα effect on HL-60 ce lls or ATRA resistant HL-60 cells
JIANG Guo-Sheng，TANG Tian-Hua，ZHANG Yu-Kun et al.
(Department of Hematology and Oncology,Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062)
Abstract Objective: To detect in vitro the effect of IFNα on HL-60 cells or ATRA res istant HL-60 cells.Methods: MTT was used to measure the proliferation of HL-60 ce lls or ATRA resistant HL-60 cells.The differentiation of HL-60 cells or ATRA res istant HL-60 cells was detected by NBT.To detect the apoptosis of HL-60 cells or ATRA resistant HL-60 cells with Flow Cytometric Analysis.Otherwise,the ATRA r es istant HL-60 cells was induced by way of ATRA density gradually-increasement.Results:IFNα could inhibit the p roliferation of HL-60 cells,especially accompanied with the ATRA. IFNα not on ly i nduce the differentiation but also promote the differentiation of HL-60 cells o r ATRA resistant HL-60 cells.ATRA resistant HL-60 cells post-treatment with IFNα were sensitive to ATRA.Conclusion: Effect on differentiation of HL-60 cells was enhanced by IFNα. IFNα also reverse the resistance of ATRA resistant HL-60 cells to ATRA.
Key words IFNα HL-60 cell Resistance
自1986年国内首创全反式维甲酸(ATRA)治疗 急性早幼粒细胞白血病(APL)获得成功 以来［1］，肿瘤诱导分化模式引起了国内外学者新一轮的广泛关注。其中本文实验 中，ATRA诱导HL-60细胞可产生耐药性，影响了ATRA的进一步有效作用［2］。因此 ， 正如化疗药物一样，如何逆转该耐药成为研究的热点之一。IFN是重要的生物活性因子，不 仅抑制肿瘤细胞生长，并证实有逆转化疗药物耐药的作用。为探讨它在诱导分化剂中的作用 ，本研究对IFNα在HL-60或其耐药细胞之间的作用特点，做了深入研究，现总结报道如下 。
1 材料与方法
1.1 细胞来源
1.1.1 HL-60细胞 山东省医学科学院免疫室张玲研究员赠送，本室自 行传代培养。
1.1.2 耐ATRA的HL-60细胞 HL-60细胞生长至对数增殖期，调整至2× 106 ml-1，以0.1 ml细胞悬 液加入96孔板中，然后加入ATRA，自1×10-9mol/L开始，按倍增浓度换液培养，至H L-60 细胞良好生长于1×10-6mol/L为止。以极限稀释法克隆，反复3次，稳定生长良好， 则ATRA耐药HL-60细胞诱导成功，称为ATRA耐药HL-60细胞。
1.2 细胞增殖实验
1.2.1 IFNα(300万U/支，USA)对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞增殖影响 收集对数生长期 HL-60或者ATRA耐药HL-60细胞，调至5×106 ml-1，以0.1 ml加入96孔培养板中 ，再加入0. 1 ml IFNα溶液(250 U/ml,500 U/ml…8 000 U/ml)。37℃,5%CO2培养72 h。按文献MTT 法进行测定 细胞增殖性，设3复孔。
1.2.2 IFNα对L-CFU形成影响 按半固体琼脂法培养［3］。即 调HL-60或ATRA耐药HL-60 细胞至1×105 ml-1，按该细胞悬液0.35 ml，2×MC COYSA 0.55 ml，0.1%PHA 1 ml混合，37℃ ,24 h。加上述IFNα 0.2 ml，0.6%Agar 1.9 ml，每浓度浇3只平皿。CO2孵育培养7 d，观察结果，计算集落数。
1.3 IFNα对HL-60细胞分化的作用 对数生长期HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞调至5×105 ml-1，培养 于 含上述不同浓度IFNα培养液中，37℃,5%CO2,72 h，取1 ml细胞悬液，加NBT溶液1 ml( 1 mg/m l),TPA 200 ng,混匀，37℃5%CO2,1 h,1 000 r/min 5 min，沉淀细胞涂片，瑞氏染色 ，油镜计200个细胞，计阳性率。
1.4 IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞凋亡影响 调对数生长期HL-60或ATRA耐药HL-60细胞为1×106 ml-1，0.1 ml加 入96 孔板中，加上述不同浓度IFNα 0.1 ml,37℃,5%CO2，饱和温度培养36 h，收集细胞 ，按流式细胞仪分析DNA含量变化，形态学观察凋亡现象。
1.5 IFNα在ATRA诱导HL-60或ATRA耐药HL-60细胞中的作用 选择2×103 U/ml，0.1 ml IFNα加入96孔板中，再加入ATRA耐 药 HL-60细胞，培养48 h后(37℃,5%CO2)，RPMI1640洗3遍(1 000 r/min 5 min)调细胞 数 1×106 ml-1，0.1 ml/孔加入96孔板中，加0.1 ml不同浓度的ATRA(10-9 …10-4mol/L)继续 培养72 h，前述MTT或NBT法测定。设HL-60细胞和ATRA耐药HL-60对照组。
2 结果
2.1 IFNα对HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞 增殖影响 图1中，IFNα随浓度加大，对HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞抑制作用增强。对HL-60细 胞或ATRA耐药HL-60细胞分别在1×103 U/ml和2×103 U/ml时开始产生明显抑制作用( P＜0.05)。
图1 IFNα对HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞增殖影响
Fig.1 Effect of IFNα on proliferation of HL-60 cells or ATRA resistan t HL-60 cells
图2 IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞L-CFU形 成影响
Fig.2 Effect of IFNα on L-CFU colonys of HL-60 cells or ATRA resista nt HL-60 cells
图3 IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞分化的诱 导作用
Fig.3 Effect of IFNα on differentiation of HL-60 cells or ATRA resist ant HL-60 cells
图4 ATRA对IFNα处理后ATRA耐药HL-60增殖作用
Fig.4 Effect of ATRA on ATRA resistant HL-60 cells treated with IFNα
图5 ATRA对IFNα处理后ATRA耐药HL-60细胞分化影 响
Fig.5 Effect of ATRA on ATRA resistant HL-60 cells treated with IFNα
2.2 IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞L-CFU形成的影响 图2显示，1×103 U/ml IFNα以上浓度可明显抑制HL-60或ATRA耐药HL-60细胞的L-CFU 形成。
2.3 IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞分化的诱导作用 由图3表明，IFNα浓度在2×103 U/ml以上，与低浓度组比，具有明显的诱导分化作用。
2.4 IFNα在ATRA诱导HL-60或ATRA耐药HL-60细胞中的作用
2.4.1 ATRA对IFNα处理后ATRA耐药HL-60细胞增殖影响 由图4显示，IFNα作用后的ATRA耐药HL-60细胞在体外恢复了明显的反应敏感性，表现为抑 制作用。
2.4.2 IFNα对ATRA耐药HL-60细胞的分化作用 图5显示，ATRA耐药HL-60细胞经IFNα作用后，体外受ATRA作用可产生诱导分化性。尤以AT RA在10-6 mol/L以上浓度明显(P＜0.05)。
3 讨论
干扰素为重要的细胞因子，业已证实具有抑制病毒，免疫调节及抑制肿瘤等作用 ［4］。尤其基因工程的发展，使重组干扰素成为现实后，推动了其临床应用及体外实验 的进展。如近年来，IFNα在化疗药物耐药中的逆转作用就是典型的例子［5］。另外 ，诱导分化剂ATRA治疗急性早幼粒白血病(APL)属我国首创，成为肿瘤诱导分化最为成功模 式［1］。然而，快速发展的耐药性仍是影响ATRA长期疗效的重要原因［2］。 因此，如何克服此耐药性显得特别重要。我们在ATRA诱导HL-60细胞耐药性与化疗药机制不 同的基础上进行了IFNα对ATRA耐药性HL-60细胞增殖与分化等方面的较深入研究。研究结 果 表明，单独IFNα在体外对HL-60细胞产生增殖抑制与分化诱导作用，而以1×103 U/ml以 上 浓度明显。流式细胞仪证实，不同浓度IFNα对HL-60的诱导凋亡数在3.52%以下，与正常 对 照(3.16%)比较，无明显差异，说明IFNα对HL-60细胞无明显诱导凋亡作用。IFNα对ATRA 耐 药HL-60细胞亦产生诱导分化及增殖抑制作用，并以2×103 U/ml以上浓度明显。并提示 IFN α与ATRA间无交叉耐药性。L-CFU形成实验亦表明，IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60的 抑制生长作用 。进一步的研究表明，经IFNα体外作用48 h的ATRA耐药HL-60细胞在体外恢复了对ATRA的 敏 感性。表现为明显的抑制增殖及诱导分化作用(1×106以上浓度)。说明IFNα可明显逆转A TRA的耐药性。
尽管传统急性早幼粒白血病(APL)细胞株为HL-60细胞。但目前NB4细胞被认为是最理想的 A PL细胞株。另一方面，体外实验和体内实验结果有时并非一致。所以有必要对NB4和原代A PL细胞进行有关的ATRA耐药及耐药逆转实验，以便为临床应用减少或逆转耐药方案提供更为 直接或肯定的依据。
本研究受省自然科学基金资助
作者简介：姜国胜，男，36岁，副研究员，血液肿瘤学研究室主任，主要从事白血病诱导分化与凋亡的研究
参考文献
1，Huang M,Yu-Chen Y,Shu-Rong C et al.Use of all transretinoic acid in treatment of acute promyelocytic leukemia.Blood,1998;72:567
2，姜国胜，唐天华，孙关林 et al.急性早幼粒白血病对维甲酸耐药性的研究进展 .白血病，1999；8(4)：251
3，姜国胜，孙关林，陈淑蓉 et al.急性早幼粒白血病患者诱导分化治疗前后血清 IL-2受体的变化及意义.中国免疫学杂志，1993；9(5)：284
4，童 杰，赵志平.干扰素与再生障碍性贫血.国外医学*免疫学分册，1987；10(5)：18 9
5，钱其军，严文伟，韩俊领.干扰素α体外逆转烷化剂马法兰耐药的研究.中华血 液学杂志，1994；15(12)：632
［收稿1999-12-05 修回2000-02-28］