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可溶性syndecan-1 对人多发性骨髓瘤细胞体外的生物学作用
中国免疫学杂志 2000年第12期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：李新燕 陆肇阳 Klein B 张学光
单位：李新燕 张学光（苏州医学院免疫学教研室，苏州 215007）；陆肇阳 Klein B（法国蒙彼利埃总医院细胞与基因治疗中心）
关键词: 人多发性骨髓瘤；可溶性 syndecan-1；肝素结合生长因子；增殖；凋亡
摘 要 目的：研究可溶性syndecan-1（CD138）分子对人多发性骨髓瘤（MM）细胞生长行为的影响及其机制。方法：用亲和层析法分离可溶性syndecan-1；借助3H-TdR 掺入、间接免疫荧光、ANNEXIN-V及PI标记分析MM 细胞增殖、凋亡及周期变化。结果：①从XG-2细胞培养上清中分离纯化得到分子量为60 kD左右的可溶性 syndecan-1 分子；②可溶性 syndecan-1分子在体外能抑制XG-1增殖，阻滞细胞增殖停留在G2/M期，并介导其凋亡； FGF、5%小牛血清、肝素酶III可逆转一定浓度可溶性 syndecan-1的作用，HGF、VEGF和IGF-1可部分逆转可溶性syndecan-1分子对细胞的生长抑制作用；③IL-6及激发型抗IL-6R130（gp130）单抗对可溶性syndecan-1作用无影响。 结论：可溶性syndecan-1分子通过不同于IL-6及其受体的信号传导途径，参与了人多发性骨髓瘤细胞的生长调控。
中国图书分类号 R733.3
The biological role of soluble syndecan-1 against human multiple myeloma cells in vitro
LI Xin-Yan LU Zhao-Yang Klein B
（Department of Immunology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007）
Abstract Objective:To explore the effects and mechanisms of soluble syndecan-1 on the behavior of human multiple myeloma (MM) cells. Methods:To purify soluble syndecan-1 from the supernatants of XG-2 cell line using chromatography; Through 3 H-TdR incorporation, Annexing-V and PI staining, we studied the biological role of purified soluble syndecan-1 on human myeloma cells in vitro.Results:① We obtained the product (molecular weight 60 kD )from cultured supernatants of XG-2 which recognized by specific anti-syndecan-1 antibody B-B4;②Purified soluble syndecan-1 inhibited the growth ,arrested cell cycle in M phase and induced apoptosis of XG-1 cells in a dose-dependent fashion in vitro, but heparitinase, fetal calf serum and fibroblast growth factor can reverse completely the effects of soluble syndecan-1, HGF,VEGF,IGF-1 reverse it partially;③IL-6 and anti-gp130 agonistic monoclonal antibodies did not show any effects on soluble syndecan-1.Conclusion:Soluble syndecan-1 participated in the regulation cell growth of MM as a competitive inhibitors and a negative regulator through one signal transduction that is different from IL-6.
Key words Human multiple myeloma Soluble syndecan-1 Heparin-binding factors Proliferation Apoptosis
syndecan-1（CD138）分子属粘附分子整合素跨膜硫酸蛋白多聚糖（heparan sulfate proteoglycan, HSPG）家族成员, 通过其分子表面的硫酸肝素侧链可结合一系列配基如细胞粘附分子、基质成分、生长因子、细胞因子、肝素结合生长因子、酶和酶抑制物等，以共受体（as cell-surface co-receptors）方式调节细胞与微环境之间的相互作用，参与组织器官分化发育、血管形成、组织再生等一系列生理过程的调节［1，2］。研究表明，syndecan-1分子能介导骨髓瘤细胞与I型胶原的特异性结合，并介导细胞之间的粘附［3］；通过基因工程技术使细胞表达syndecan-1分子，然后注射到SCID小鼠体内，结果肿瘤的发展及其相关症状都得以缓解；而且可溶性syndecan-1分子可以通过抑制破骨细胞的形成和促进成骨细胞的分化而影响骨细胞的分化和微环境中肿瘤细胞的生物行为［4］。由此可见，syndecan-1分子对调节MM的病理过程也具有很重要的作用。本研究在以前工作的基础上，分离纯化可溶性syndecan-1 分子，研究其在体外对MM细胞生长行为的影响，探讨可溶性syndecan-1 分子在体内作为MM病理过程中的负性调节因子的作用及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞因子及其它试剂 人重组白细胞介素6（rhIL-6）由法国Klein 博士赠送；人纤维母细胞生长因子(bFGF)、人肝细胞生长因子(HGF)、 胰岛素样结合生长因子-I(IGF-I)、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、肝素酶III(heparitinase)、分析纯牛血清白蛋白均为Sigma公司产品；无血清条件培养基X-VIVO20、RPMI1640及胎牛血清(FCS)均为Biowhittaker (Walkersville, USA)公司产品；3H-TdR为北京原子能研究院产品。
1.1.2 单克隆抗体 抗人IL-6受体gp130激发型单抗BS12和BP8由本室研制［5］。抗syndecan-1单抗MI-15、B-B2、B-B4皆由法国Klein博士赠送；正常小鼠IgG、 兔抗鼠IgG-FITC单抗均购于法国IMMUTECH公司；FITC-ANNEXIN-V为 Boehringer Mannheim公司产品。PI(propidiumiodide)购自Sigma公司。
1.1.3 其他材料 溴化氰活化的sepharose-4B(CNBr-activated Sepharose 4B)及凝胶柱Sephadex Q为 Pharmacia Biotech公司产品。
1.2 方法
1.2.1 人MM细胞株（HMCL)的培养 IL-6依赖MM细胞株XG-1、 2、6、7由本室建立［6］,用含rhIL-6（3 ng/ml）和10%FCS的RPMI1640全培养基培养。IL-6非依赖MM细胞株RPMI8226及U266（引自美国ATCC）均用RPMI1640/10％FCS全培养基维持培养。
1.2.2 XG-2上清的制备,可溶性syndecan-1分子的纯化及鉴定 由于XG-2细胞可分泌高水平的可溶性syndecan-1［7］，因此制备该细胞的培养上清：调整XG-2细胞浓度为5×105 ml-1,用含IL-6（3 ng/ml）和10％FCS的RPMI1640培养基，37℃,5%CO2培养3 d，常规离心收集培养上清，0.22 μm滤器过滤，-80℃保存备用。用抗syndecan-1分子单抗B-B2交联溴化氰活化的Sepharose-4B。XG-2培养上清上柱前，用含0.25 mol/L NaCl的PBS稀释1.5倍；用50 mmol/L 0.1%Triton-X 100 pH11.5的TEA缓冲液洗脱后，立即用Tris缓冲液中和pH至7.4；然后将洗脱产物通过凝胶柱Sephadex Q，用含2 mol/L NaCl的pH7.7的TEA缓冲液洗脱；用SDS-PAGE银染及酶标测定方法作定性和定量分析。
1.2.3 可溶性syndecan-1分子与膜表面syndecan-1分子竞争结合实验 分别用抗syndecan-1 分子抗体MI-15、B-B4、B-B2（各2 μg/106细胞）标记XG-1、XG-2、XG-6及U266细胞，并加入纯化的可溶性syndecan-1分子（2 μg/test）,按本室建立的常规免疫标记方法进行。于流式细胞仪( FACScan,Becton Dickinson, Montain View,CA)分析结果。
1.2.4 细胞增殖抑制试验 选用XG-1、XG-2、XG-6、U266细胞株，用X-VIVIO 20,3 ng/ml rhIL-6无血清条件培养基培养。调整浓度1×105 ml-1,接种至96孔培养板，100 μl/孔 (每个样本6 个复份),加入不同浓度的可溶性syndecan-1分子（0～500 ng/ml），同时设置不同的实验对照:肝素酶III 0.1 U/ml、FGF 30 ng/ml、HGF 150 ng/ml、VEGF 100 ng/ml、IGF-I 100 ng/ml、 5%小牛血清，置37℃,5%的CO2培养箱培养72 h，终止前16 h，每孔加入0. 5 μCi 3H-TdR。收集细胞，用液闪法测定cpm。
1.2.5 IL-6、BS12、BP8 增殖实验 为研究外源性IL-6与可溶性syndecan-1间的相互作用，选用X-VIVO 20培养基，调整XG-1细胞浓度1×105 ml-1, 接种至96孔培养板，100 μl /孔(每个样本6 个复份),分别加入不同浓度的IL-6（0～300 ng/ml）和BS12、BP8 单抗（0～20 μg/ml）,并同时加入一定浓度的可溶性syndecan-1分子（10 ng/ml），置37℃,5%的CO2培养箱培养72 h，方法同上。
1.2.6 细胞凋亡及周期分析 用X-VIVO20 无血清条件培养基培养XG-1、XG-2、XG-6及U266细胞株，调整浓度 1×105 ml-1，接种至24孔板，每孔 1 ml,加入不同浓度的可溶性syndecan-1分子(0、1、10、100 ng/ml) 及肝素酶III（0.1 U/ml），37℃,5%的CO2培养箱培养3～5 d。每天台盼蓝活细胞计数，并标记
表1 纯化的可溶性syndecan-1分子对XG-1细胞周期的影响
Tab.1 The effect of purified soluble syndecan-1 on the cell cycle of XG-1
| G0/G1(%) | G2/M(%) | S(%) | |
| Control | 32 | 15 | 53 |
| Soluble syndecan-1 10 ng/ml | 10 | 52 | 38 |
图1 从XG-2细胞培养上清中分离得到分子量为60 kD左右的可溶性syndecan-1分子
Fig.1 Purified soluble syndecan-1(60 kD) from the cultured supernatants of XG-2 cells
图2 可溶性syndecan-1和膜表面syndecan-1竞争性与抗syndecan-1单抗结合
Fig.2 Soluble syndecan-1 competed to combine anti-syndecan-1 mAb with membrane syndecan-1
Note：AC.anti-syndecan-1 mAb;AC+ssdcn-1.anti-syndecan-1 mAb and soluble syndecan-1
图3 可溶性syndecan-1以及某些因子对XG-1细胞生长的影响
Fig.3 Soluble syndecan-1 and cytokines effect on the growth of XG-1 cells
图4 可溶性syndecan-1诱导XG-1细胞调亡及肝素酶的逆转作用
Fig.4 Apoptosis induced by soluble syndecan-1 and anti-apoptosis by heparitinase
Note:the upper.s-synd;the lower.heparitinase
Annexin-V(具体操作详见产品说明书)，流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率；同时收取培养48 h的细胞标记PI（10% V/V RNase, 0.1%Tween-20,PI 25 μg/ml）,4℃,2 h后，流式细胞仪检测结果，ModFit LT分析软件分析细胞周期不同阶段DNA的含量。
1.2.7 统计学处理 所得实验数据进行未配对资料的t检验。
2 结果
2．1 MM 细胞表达和分泌功能性syndecan-1分子
2．1．1 采用SDS-PAGE电泳银染方法，证实XG-2细胞培养上清中存在分子量为60 kD左右的可溶性syndecan-1分子（图1示），与文献报道相一致［8］。酶标定量浓度为1×105 U/ml，经标准牛血清白蛋白（BSA）标定，1 000 U相当于450 ng。
2．1．2 可溶性syndecan-1分子能与XG-1、XG-2、XG-6、U266细胞膜表面的syndecan-1分子竞争性地与抗syndecan-1抗体结合（结果见图2），表明MM细胞表达和分泌功能性syndecan-1分子。
2．2 可溶性syndecan-1分子在体外呈剂量依赖方式抑制XG-1细胞增殖并介导凋亡
2．2．1 经3H-TdR掺入实验证实，可溶性syndecan-1分子以剂量依赖方式抑制XG-1细胞的体外生长，其50%抑制剂量为10 ng/ml。30 ng/ml FGF、5%牛血清及0.1 U/ml肝素酶III可以完全逆转10 ng/ml 的可溶性syndecan-1分子的作用；HGF、VEGF、IGF可部分逆转10 ng/ml可溶性syndecan-1分子的作用(图3所示)。但在同样实验条件下，对自分泌可溶性syndecan-1分子的细胞株XG-2、XG-6及U266却不显示明显的生长抑制作用。
2．2．2 细胞周期分析显示，可溶性syndecan-1分子使细胞增殖周期停留在G2/M期（如表1所示）。
2．2．3 由于ANNEXIN-V可以识别早期凋亡细胞暴露于膜表面的磷脂酰丝氨酸分子，我们采用ANNEXIN-V标记方法，观察可溶性syndecan-1分子对细胞凋亡的影响。结果如图4所示，可溶性syndecan-1分子可以在体外介导XG-1细胞的凋亡，肝素酶III则完全逆转它的作用。同样情况下，对于其它自分泌可溶性syndecan-1分子的细胞株XG-2、XG-6、U266以及新鲜肿瘤细胞无明显作用（结果未显示）。
2．3 一定浓度的IL-6 及激发型抗gp130抗体(BS12和BP8)在体外对可溶性syndecan-1的作用无明显影响（如图5所示），证实syndecan-1对MM细胞的生物学效应与IL-6及其受体无关。
图5 IL-6和gp130激发型单抗对可溶性syndecan-1作用的影响
Fig.5 The effects of IL-6 and anti-gp130 agonistic mAb on soluble syndecan-1
Note:A.IL-6;B.anti-gp130 mAb
3 讨论
IL-6及其受体gp130家族作为MM病理过程的关键正性调节因子，已被大量实验证实。但是，许多参与血管形成并具有趋化活性或丝裂原活性的分子如FGF、VEGF、HGF、IGF-1等也参与MM的发生、发展，甚至与预后有关。FGF-2 是血管生成和单核细胞的趋化因子，参与调节组织器官分化发育的正常生理过程，同时也参与诸如炎症反应、损伤修复、肿瘤的形成与转移等多种病理过程。研究表明，来自活动期MM患者浆细胞的条件培养基能刺激人脐带静脉内皮细胞增殖、分化和单核细胞的趋化性，同时其浆细胞提取物含有高水平FGF和VEGF，参与MM骨髓微环境血管形成［9］。值得注意的是，syndecan-1分子能与bFGF低亲和力受体结合，介导bFGF活性的发挥［10］ 。HGF具有丝裂原活性，能刺激血管形成，促进细胞增殖、侵入和移动，参与肿瘤的发生和转移［11］。人MM细胞株和新鲜细胞同时表达HGF和它的受体c-met，MM患者HGF水平明显升高，并与MM的预后呈正相关［11］。与此同时，HGF是肝素样结合生长因子，通过与syndcan-1分子表面硫酸肝素侧链（HS）结合而发挥功能。IGF-1也具有刺激细胞增殖、分化和胰岛素样代谢性反应［12］，同时它又是MM细胞生存和增殖因子并对MM细胞具有趋化活性，参与MM细胞的移行与归巢［12］。由此可见，人多发性骨髓瘤的发生、发展受多水平、多因素调节，包括负性调控因子如地塞米松、IL-4、IFN-γ等，但这些因子的体外作用均可被外源性IL-6所逆转。
我们通过研究MM细胞膜及可溶性syndecan-1的表达、分泌及其调节，建立了体外研究可溶性syndecan-1分子功能的两个细胞膜：XG-1、XG-2细胞表面表达几乎相同密度的syndecan-1 分子，但 XG-1细胞却不分泌可溶性 syndecan-1分子，XG-2细胞分泌高水平的可溶性syndecan-1。在此基础上，我们首次证实，可溶性syndecan-1在体外无血清培养条件下，可抑制XG-1细胞生长并介导凋亡，而牛血清、FGF、肝素酶III可以完全逆转，HGF、VEGF可部分逆转此作用。而且IL-6及抗IL-6Rgp130的激发型抗体对上述作用无影响，表明可溶性syndecan-1的作用可能是通过其分子表面的HS侧链，并循一条不同于IL-6的信号传导途径，通过竞争性地与syndecan-1结合因子结合，使得膜表面syndecan-1的功能被抑制；或直接与各种生长因子结合，作为一种负性调节因子，参与MM细胞的生长、发展。有关其确切机制尚待进一步研究。
本课题受国家自然科学青年科学基金资助（39700130）
作者简介：李新燕，女，博士，副教授，主要从事肿瘤免疫研究；张学光，男，博士生导师，教授，主要从事肿瘤免疫及免疫血液学研究
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收稿2000-01-30
修回2000-05-15