登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射诱导小鼠免疫应答的初步研究

登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射诱导小鼠免疫应答的初步研究

中国免疫学杂志 2000年第12期第16卷 分子与细胞免疫学

作者：洪帮兴　江丽芳　张欣　郭辉玉

单位：洪帮兴（中山医科大学微生物学教研室，广州510089）；江丽芳 张欣 郭辉玉（广东省深圳市福田卫生防疫站，深圳518033）

　　关键词: 登革病毒；基因免疫；免疫应答

　　摘　要　目的：研究登革病毒E基因免疫的可行性。方法：用脂质体转染法将构建的E基因重组真核表达质粒pcDNA3-E导入小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞，SDS-PAGE和蛋白质印迹试验检测E基因的体外表达。然后将该重组真核表达质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠，检测其诱发特异性免疫应答水平。结果：重组真核表达质粒pcDNA3-E在小鼠体内诱发一定水平的体液和细胞免疫应答，且持续时间较长。结论：登革病毒E基因免疫可诱发特异性免疫应答，为登革病毒疫苗的研制提供了实验依据。

　　中国图书分类号　R373.33

Immunogenicity of dengue virus E antigen gene in BALB/c mice

HONG Bang-Xing　JIANG Li-Fang　ZHANG Xin

　　（Department of Microbiology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089）

　　Abstract　Objective:To study the possibility of dengue virus E gene vaccine.Methods:The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3-E was first transfected into NIH3T3 cells by lipofectin.SDS-PAGE and Western blotting analyzed the expression of E gene.Then the recombinant plasmid was intramuscularly injected to BALB/c mice,and the specific humoral and cellular immunity were tested.Results:The recombinant plasmid DNA could induce specific immune reactions and the immune response could last a long time.Conclusion:The dengue virus E gene vaccine could induce specific immune reaction,which might have provided some material and new experimential data for the further study of dengue vaccines.

　　Key words　Dengue virus　Gene vaccine　Immune response

　　基因免疫(又称核酸疫苗)是近年来发展起来的一项新生物技术，它克服了传统疫苗研制的繁琐过程等缺点，为传染病疫苗的研制带来了新的希望和应用前景^［1］。登革病毒是一种蚊媒急性传染病病原体，他所引起的登革热、登革出血热和登革休克综合征目前尚无特异的预防措施。Kochel等首先对登革病毒的核酸免疫作了探索性的研究，取得了可喜的结果^［2，3］。本研究选取针对登革病毒感染及保护性免疫应答中起重要作用的E蛋白，将构建的含登革病毒E基因的重组真核表达质粒pcDNA3-E免疫BALB/c小鼠，研究该基因在小鼠中的免疫应答情况。

　　1　材料与方法

　　1.1　重组真核表达质粒　重组真核表达质粒pcDNA3-E(6.8　kb，含登革病毒全长E基因)由本室构建。

　　1.2　细胞和动物　小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞由本室保存，BALB/c小鼠由中山医科大学动物中心提供。

　　1.3　试剂　Lipofectin脂质体购自Promega公司，FITC-CD3/PE-CD4和FITC-CD3/PE-CD8单抗购自基因有限公司，HRP-羊抗兔IgG和HRP-免疫鼠IgG购自Sigma公司，兔抗登革2型病毒多克隆抗体和登革2型病毒单抗由本室自行制备，³H-TdR为中科院原子能研究所产品。

　　1.4　E蛋白抗原基因的表达　重组真核表达质粒pcDNA3-E经酚、氯仿/异戊醇(24∶1)抽提纯化后备用，NIH3T3细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液37℃培养至50%～80%融合，用脂质体转染法将重组真核表达质粒pcDNA3-E导入NIH3T3细胞，空质粒作转染对照，NIH3T3细胞作空白对照。转染16 h后用含600 μg/ml G418的DMEM培养液筛选培养，3 d后更换含250 μg/ml G418的DMEM培养液维持筛选直至阳性细胞克隆的形成，SDS-PAGE和蛋白质印迹试验检测表达蛋白。

　　1.5　小鼠免疫　按常规方法大量抽提重组真核表达质粒pcDNA3-E和空载体pcDNA3。健康雄性BALB/c小鼠，6周龄，每组5只。DNA溶液注射于小鼠右下肢股四头肌，注射剂量分别为100 μg/只和200 μg/只。实验共分为pcDNA3组、pcDNA3-E组和空白对照组(注射PBS)。每隔2 w加强免疫1次，共3次。

　　1.6　ELISA法检测特异性抗体　登革病毒抗原制备参见文献［4］。小鼠免疫前及末次免疫后第2周始每隔2 w自小鼠尾静脉采血50 μl，分离血清。鼠抗血清自1∶300始倍比稀释，每个血清稀释4孔，HRP-兔抗鼠IgG 1∶1 000稀释。鼠抗登革2型病毒单抗作阳性对照。

　　1.7　小鼠脾脏T细胞CD4⁺、CD8⁺亚群的检测　末次免疫后2 w随机取实验组和对照组BALB/c小鼠各4只，制备脾细胞悬液，用Hanks液调整细胞数至10⁶ ml^-1，分别加入FITC-CD3/PE-CD4和FITC-CD3/PE-CD8单抗，混匀后室温放置30 min，用流式细胞仪计算CD3⁺CD4⁺T细胞亚群和CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的百分率。

　　1.8　淋巴细胞转化试验　末次免疫后2 w，随机取试验组和对照组小鼠各3只，取出脾脏，加入3 ml不含小牛血清的1640液，磨碎后转入已有2 ml淋巴细胞分离液的离心管中，2 000 r/min离心5 min，取中间乳白色液体，用5倍以上体积的1640液洗3次，弃上清，用含10%小牛血清的1640培养液调整细胞浓度为2×10⁶ ml^-1，加入96孔培养板，每孔100 μl，试验孔加100 μl PHA(10 μg)，对照组加1640培养液，37℃5%CO₂培养70 h。培养终止前24 h加入³H-TdR 1 μCi/孔，用多头细胞收集器收集细胞，以液闪仪测定cpm值；MTT法测定时于培养终止前4～6 h，弃上清，再加5 mg/ml MTT 10 μl，混匀再培养。细胞终止培养后加酸化异丙醇0.1 ml，混匀静置数分钟，待细胞代谢MTT形成紫蓝色颗粒后，用酶标光度计于570 nm波长测定吸光度(A)值。

　　2　结果

　　2.1　E基因的真核表达　重组真核表达质粒pcDNA3-E经脂质体转染NIH3T3细胞，用含G418的DMEM培养液筛选培养20 d后，有阳性细胞克隆的形成，转染对照及空白对照的NIH3T3细胞则全部死亡。SDS-PAGE和蛋白质印迹试验均证实在分子量60 kD处有特异蛋白的表达，见图1。

　　2.2　pcDNA3-E免疫小鼠抗体滴度的检测　实验组和对照组小鼠于末次免疫后2～10 w取尾静脉血作ELISA检测其抗体滴度。结果表明，实验组小鼠大多数抗体滴度为在1∶1 600左右，而对照组小鼠抗体滴度均小于1∶300，用2组随机设计资料均数比较的t检验，差异有高度显著性(P＜0.01)，而不同剂量组之间差异不显著(P＜0.05)，见图2。

　　2.3　小鼠脾脏T细胞CD4⁺、CD8⁺亚群的检测　末次免疫后实验组和对照组BALB/c小鼠的脾细胞经双色荧光标记的单克隆抗体染色后，用流式细胞仪检测CD3⁺CD4⁺T细胞亚群和CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的百分率。结果表明，实验组CD3⁺CD4⁺T细胞亚群和CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的百分率明显高于对照组，实验组CD3⁺CD4⁺T细胞亚群和CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的比值也高于对照组。用两组随机设计资料均数比较的t检验，差异有显著性(P＜0.05)，而不同剂量组之间差异不显著(P＞0.05)，见图3。

图1　SDS-PAGE和Western blotting检测表达蛋白

　　Fig.1　Detection of expression protein by SDS-PAGE and Western blotting

　　Note:M:protein marker;1:NIH3T3 cells;2:NIH3T3 cells transfected by pcDNA3-E plasmid;3:NIH3T3 cells transfected by pcDNA3 plasmid;4:Western blotting of NIH3T3 cells transfected by pcDNA3-E plasmid

图2　重组质粒pcDNA3-E免疫后不同时间小鼠体内抗体水平

　　Fig.2　Antibody level of mice after immunization with recombinant plasmid pcDNA3-E

图3　重组质粒pcDNA3-E免疫后(8 w)对T淋巴细胞的影响

　　Fig.3　The results of T lymphocyte counts after immunization with recombinant plasmid pcDNA3-E

表1　重组质粒pcDNA3-E免疫后(8 w)对淋巴细胞增殖反应的影响

　　Tab.1　The activation of lymphocyte after immunization with recombinant plasmid pcDNA3-E

Group	cpm　　　　　　　　　　　OD570
	(
PBS	992.35±105.76	0.17±0.02
pcDNA3(100 μg)	913.41±113.87	0.18±0.01
pcDNA3(200 μg)	1 012.03±156.55	0.19±0.02
pcDNA3-E(100 μg)	2 568.79±185.63	0.52±0.031)
pcDNA3-E(200 μg)	2 293.13±212.98	0.47±0.021)

　　note:1)P＜0.05,compared with PBS group2.4　淋巴细胞转化试验　末次免疫后取试验组和对照组小鼠的脾脏，分离淋巴细胞作淋巴细胞转化试验。结果表明，实验组cpm值和OD570值明显高于对照组，见表1，用两组随机设计资料均数比较的t检验，差异有显著性(P＜0.05)，而不同剂量组之间差异不显著(P＞0.05)。

　　3　讨论

　　核酸疫苗有病毒亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效性，成为疫苗研究的新方向^［5］。它的作用机理是将带有目的蛋白编码基因和表达调控序列的质粒DNA导入机体组织后，在机体组织细胞内表达病原体的蛋白抗原，加工后形成的多肽抗原与宿主细胞MHCⅠ类和MHCⅡ类分子结合，并被递呈给宿主的免疫识别系统，从而诱发特异性体液和细胞免疫应答^［6］。它的优点是抗原在细胞内的表达与自然感染相似，这一特点对构成依赖性抗原表位诱发保护免疫尤为重要^［7］。Megret等通过合成肽结合McAb分析E蛋白上的抗原表位，发现非中和性抗体对应的表位呈线性，而中和抗体其对应的表位呈构象依赖性^［8］。因此选取E基因作为研制登革核酸疫苗的靶基因，是值得探索的途径之一。本研究首先将含登革病毒E基因的重组真核表达质粒导入小鼠NIH3T3细胞，SDS-PAGE和蛋白质印迹试验均检测到E蛋白的体外真核表达，这为该质粒的核酸免疫提供了体外实验依据。而后将该质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠，无论是体液免疫还是细胞免疫，都有较高的免疫应答，高滴度抗体水平持续至免疫后10 w仍保持不变。在细胞免疫方面，基因免疫组小鼠的T淋巴细胞百分率和淋巴细胞转化率均高于对照组，这表明重组真核表达质粒pcDNA3-E在小鼠体内诱发了有效的体液和细胞免疫应答，但诱发机体免疫应答的持续时间、免疫效应及外源基因是否与宿主基因组整合等有待进一步研究。

　　广东省自然科学基金资助课题(5221100203017)

　　作者简介：洪帮兴，男，25岁，硕士，主要研究分子病毒学；指导教师：江丽芳，女，46岁，副教授，硕士生导师，主要从事登革病毒致病与免疫研究

参考文献

　　1，Wang B,Ugen K E，Srikantan V. Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Sci USA,1993;90(9):4156

　　2，Kochel T,Wu S J,Raviprakash K.Inoculation of plasmids expressing the dengue 2 envelope gene elicit neutralizing antibodies in mice.Vaccine,1997；15(5):547

　　3，Kochel T,Porter K R，Raviprakash K.Protective efficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG immune stimulatory motifs on antibody responses.Arch Virol,1998；143(5):997

　　4，姜　泊主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：165

　　5，Roberson A.DNA-based vaccines:new possibilities for disease prevention and treatment.Can Med Assoc J,1995;(10):1629

　　6，Cohen J. Naked DNA points way to vaccines:direct injections of a gene from the influenza A virus can immnurize mice,sparking hopes that this simple and cheap approach can trip up other cunning pathogens.Science,1993;259:1691

　　7，Spier R E.Nucleic acid vaccines,17-18,1994,WHO(OMS),Geneva,Switzerland.Vaccine,1995；13(1):131

　　8，Megret F,Hugnnot P, Deubel V. Use recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on dengue virus envelope glycoprotein.Virology,1992；187:480

收稿1999-10-22

　　修回2000-01-14