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山茱萸总甙对HUVEC表达ICAM-1、CD44的影响
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 中医中药与免疫
作者：李建民 周勇 张丽 高杰英 赵世萍 付桂香 王旭丹
单位：李建民 周勇 张丽 王旭丹(北京中医药大学中西医结合研究所免疫室，北京 100029)；高杰英(军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京100071)；赵世萍 付桂香(中日友好医院临床研究所药物药理室，北京 100000)
中国图书分类号 R392.11 R967
血管内皮细胞的活化在炎症疾病过程中起着重要作用,活化的血管内皮细胞可以表达粘附 分子如ICAM-1和CD44,使中性粒细胞和淋巴细胞与其粘附、穿越内皮而进入炎症部位,研究 表 明中性粒细胞可通过其膜表面表达的配体与ICAM-1相互作用而粘附于血管内皮细胞的表面, C D44在炎症组织表达增高［1］,并且也与中性粒细胞的侵润有关。我们的初步研究 发现:从山茱 萸中提取的总甙类物质具有免疫抑制作用,为了深入探讨其机理,本实验应用Cell-ELISA方 法 研究山茱萸总甙(Total Glycosides from Cornus Officinalis,TGCO)对促炎性细胞因子IL -1和TNF-α诱导人血管内皮细胞系ECV304表达ICAM-1和CD44的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 DME培养基GIBCO公司产品, 使用时加入青霉素100 U/ml， 链霉素100 μg/ml和20% 新生小牛血清。胰蛋白酶为Sigma产品，胰蛋白酶用0.9%的生理盐水配成0.25%浓度与0.0 3% EDTA按1:1混匀消化细胞。rIL-1、rTNF-α、BSA、Tween-20、TMB、HRP羊抗鼠IgG抗体购 于北 京邦定公司，anti-ICAM-1（鼠抗人1：3 000）和anti-CD44（鼠抗人1：3000）单抗，由 军事 医学科学院微生物流行病研究所免疫室罗振革博士和孔祥英老师惠赠，其它为国产分析纯。
1.1.2 药物 地塞米松5 mg/ml,天津市氨基酸公司 人民制药厂，批号:990512。山茱萸总甙由中日友好医院临研所赵世萍提供。
1.2 方法
1.2.1 血管内皮细胞系ECV304的传代培养 EVC304细胞系为安贞医院细 胞免疫室培养，本 室引进后传代培养，调整细胞浓度为2×105分种于1%明胶预包被的96孔板上，置37℃、5% CO 2条件下培养。至形成致密单层后，去除培养上清，冲洗后的EVC304单层用于ICAM-1、CD 44的表达。
1.2.2 山茱萸总甙对EVC304细胞系表达ICAM-1、CD44的影响 rIL-1 和rTNF-α诱导EVC304细胞系表达ICAM-1、CD44的比较： 在含有EVC3 04单层 的96孔内，分别加入rIL-1终浓度为100 U/ml、rTNF-α终浓度为400 U/ml和阴性对照组, 每 孔200 μl,每组重复8孔,诱导24 h；山茱萸总甙对ECV304细胞系表达ICAM-1、CD44的影响 ：同时分别设立rIL-1（ 终浓 度为100 U/ml ）、rTNF-α（终浓度为400 U/ml）与山茱萸总甙的不同剂量组（山茱萸总 甙的 终浓度分别为62.5、125、250 μg/ml）;地塞米松（终浓度为10 μg/ml）分别与r I L-1（ 终浓度为100 U/ml）和rTNF-α（终浓度为400 U/ml）组, 每孔200 μl，每组重复 8孔,同 时诱导、作用24 h，检测山茱萸总甙(TGCO)不同剂量和地塞米松(DEX)对血管内皮细胞表达I CAM-1、CD44的影响。
1.2.3 ICAM-1、CD44抗原的检测［2］ 上述EVC304单层，用pH 7.2的PBS冲洗2遍，用1%戊二 醛4℃固定30 min,用含0.05%Tween20的PBS洗板3次，用3%BSA、200 μl/孔，封闭37℃40 m in,洗 板（用含0.05%Tween20的PBS洗板3次）后加入鼠抗人anti-ICAM-1、anti-CD44抗体，50 μl/ 孔，37℃置1 h，洗板（用含0.05%Tween20的PBS洗板3次）后加HRP羊抗鼠IgG抗体(1:2 000 )1 00 μl/孔，37℃置1 h，洗板后加TMB-H202 100 μl/孔，37℃显色15 min,加100 μl 、1 mol/L H2SO4终止反应。450 nm处读取光密度值。
2 结果
2.1 山茱萸总甙对rTNF-α诱导ECV304表达ICAM-1和CD44的影响 结果表明：与未加rTNF-α诱导的阴性对照组相比, rTNF-α(400 U/ml)组可明显增加ECV 304 表达ICAM-1和CD44(P＜0.01)。不同浓度的山茱萸总甙均可明显抑制rTNF-α诱导ECV3 04表达ICAM-1 和CD44(P＜0.01)。
2.2 山茱萸总甙对rIL-1诱导ECV304表达ICAM-1和CD44影响 结果表明：与未加rIL-1诱导的阴性对照组相比, rIL-1(100 U/ml)组可明显增加ECV304表 达I CAM-1和CD44(P＜0.01)。不同浓度的山茱萸总甙均可明显抑制rIL-1诱导ECV304表达I CAM-1和CD44 (P＜0.01)。
表1 山茱萸总甙对rTNF-α诱导ECV304表达ICAM-1 和CD44影响(
Tab.1 Effects of TGCO on rTNF-α induced expression of ICAM-1 and CD 44 on ECV304 (
| Groups | Dose | n | OD | |
| ICAM-1 | CD44 | |||
| Control group | - | 8 | 0.054±0.017 | 0.067±0.024 |
| rTNF-α group | 400 U/ml | 8 | 0.220±0.0241) | 0.210±0.0391 ) |
| DEX | 10 μg/ml | 8 | 0.082±0.0112) | 0.104±0.0252) |
| TGCO | 250 μg/ml | 8 | 0.061±0.0282) | 0.090±0.0442) |
| TGCO | 125 μg/ml | 8 | 0.069±0.0332) | 0.103±0.0302) |
| TGCO | 62.5 μg/ml | 8 | 0.077±0.0282) | 0.120±0.0232) |
note:1) as compared with control group P＜0.01；2)as compared with TNF-α group P＜0.01
表2 山茱萸总甙对rIL-1诱导ECV304表达ICAM-1CD44影响(
Tab.2Effects of TGCO on rIL-1 induced expression of ICAM-1 and CD44 on ECV304 (
| Groups | Dose | n | OD | |
| ICAM-1 | CD44 | |||
| Control group | - | 8 | 0.054±0.017 | 0.067±0.024 |
| IL-1 group | 400 U/ml | 8 | 0.240±0.0351) | 0.240±0.0201) |
| DEX | 10 μg/ml | 8 | 0.078±0.0202) | 0.130±0.0432) |
| TGCO | 250 μg/ml | 8 | 0.058±0.0172) | 0.094±0.0302) |
| TGCO | 125 μg/ml | 8 | 0.068±0.0342) | 0.130±0.0282) |
| TGCO | 62.5 μg/ml | 8 | 0.075±0.0162) | 0.150±0.0362) |
note:1) as compared with control group P＜0.01，2)as compared with I L-1group P＜0.01
图1 TNF-α和IL-1诱导ECV304表达ICAM-1的比较
Fig.1 Induced expression of ICAM- different between TNF-α and IL-1 on ECV 304
图2 TNF-α和IL-1诱导ECV304表达CD44的比较
Fig.2 Induced expression of CD44 different between TNF-α and IL-1 on ECV304
3 讨论
炎症过程中最重要的特征是白细胞粘附，穿越血管内皮细胞，向炎症部位渗出。不同的 炎症具有不同的炎性细胞侵润，如急性炎症以中性粒细胞渗出和侵润为主，而慢性炎症则以 淋巴细胞侵润为主，其分子基础在于白细胞和淋巴细胞膜表面表达的配体与血管内皮细胞表 面表达的粘附分子的相互作用以及细胞因子等因素对粘附分子表达的调节。作为促炎性细胞 因子的TNF-α和IL-1，一方面作为炎性介质,通过自分泌和旁分泌作用放大炎症反应，另 一 方面可以促进血管内皮细胞活化并表达粘附分子如ICAM-1和CD44，ICAM-1可以和中性粒细 胞 表面的CD11/CD18配体结合介导中性粒细胞沿血管内皮滚动(rolling)、稳定粘附,最后穿越 内皮细胞向炎症部位迁移，CD44分子可以和透明质酸(HA)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型和Ⅵ胶 原蛋白等多种配体结合，作为淋巴细胞归巢受体，可介导淋巴细胞向外周淋巴组织归巢。近 年来研究表明:在炎症组织中，CD44分子的表达增加［3］ ，并参与中性粒细胞向炎 性组织的 迁移［4］，提示CD44分子在炎性反应中起着重要作用，而外周血中淋巴细胞膜表面 表达的CD44分子的激活可能是自身免疫性疾病(如SLE和RA)活动的标志［5］。
ECV304是由人脐静脉内皮细胞转化的细胞系，可以表达内皮细胞标志如Weibel-Palada 小体、PA等，它可以进行稳定传代培养,是原代内皮细胞培养的良好模型［6］。因此 本研究选 用ECV304细胞系作为研究对象，以促炎性细胞因子的rTNF-α和rIL-1诱导血管内皮细胞活 化 ，模拟血管内皮细胞在炎性条件下的环境。我们的研究发现rTNF-α和rIL-1均可诱导血管 内 皮细胞活化而明显表达ICAM-1和CD44，与国外研究报道相一致［1，7］。地塞米 松是一种广 泛应用的糖皮质激素可以减少促炎性细胞因子TNF-α和IL-1的合成及抑制其mRNA基因转录 ， 抑制急慢性炎性反应中的中性粒细胞和内皮细胞的粘附，抑制由细胞因子激活的粘附分子mR NA基因转录［2，8］。本研究结果表明地塞米松可以抑制rTNF-α和rIL-1诱导ECV3 04表达ICAM-1和CD44，可能是抑制中性粒细胞进入炎症部位的分子基础之一。
山茱萸总甙是从山茱萸中提取的总甙类化合物，我们的初步研究发现山茱萸总甙可以抑 制T、B淋巴细胞增殖,抑制大鼠佐剂性关节炎的腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1、IL-6等 ， 具有免疫抑制作用。本研究结果表明山茱萸总甙可以明显抑制rTNF-α和rIL-1诱导ECV304 表 达ICAM-1和CD44表达，并呈明显的量-效关系，抑制血管内皮细胞的活化表达ICAM-1和CD 44可能是山茱萸总甙的免疫抑制机理的分子基础之一。
国家新药研究基金(96-901-05-177)
作者简介：李建民，男，37岁，在读博士,中西医结合副主任医师,主要从事肾内科和中医中药的 免疫调节研究；指导教师： 周 勇，男，64岁，研究员，博士生导师, 主要从事中医中药的免疫调节研究；高杰英，女，63岁，研究员，博士生导师,主要从事基础免疫学和基因疫苗研究
参考文献
1，Katherine A，Fitzgerald，Luke A et al. Characterization of CD44 inducti on by IL-1:Acritical role for Egr-1. J Immunology，1999；162：4920
2，张庆殷，何维敬，候桂华et al.地塞米松对HUVEC表达粘附分子的影响.免疫学杂 志，1998；15(1):35
3，Haynes B L，Hale P, Patton K L et al.Measurement of an adhesion mole cule as an indicator of inflammatory disease activity. Arthritis Rheum，1991；345:1434.
4，Aruffo A， Stamenkovic T， Melnik M et al. CD44 is the principle cell su rface recepter for hyaluronate.Cell，1990；61:1303.
5，Pill E, DeGrendele H C, Virginiapascual et al. Functional act ivation of lymphocyte CD44 in peripheral blo od is marker of autoimmune disease activity. J Clin Invest，1998；102(6)：117 3
6，Bowie A G， Moynagh P，Neill I A J O et al. Lipid peroxidation is invo lved in the activation of NF-κ B by tumour necrosis factor but not interleukin-1in the human endothelial cell line ECV304.J Biol Chem，1997；272:25941
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8，Frank B,Maki W,Gerd R B et al. A new hypothes is of modular corticosteroids action:steroid treatment of rheumatic diseases rev isited.Arthritis Rheum,1998;41(5):761
［收稿2000-05-16 修回2000-06-29］