点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨MMP-2、CD44v6和肿瘤间质微血管密度（Microvascular density，MVD）与非小细胞肺癌临床病理特征及患者生存期的关系。方法 采用免疫组织化学S-P法，检测73例随访资料完整的非小细胞肺癌MMP-2、CD44v6的表达，并在CD34标记切片检测肿瘤间质MVD。结果 非小细胞肺癌MMP-2表达阳性率在腺癌组和淋巴结转移组较高（P<0.05），MMP-2表达阳性组较阴性组的肿瘤间质MVD高（P=0.019），MMP-2表达阳性组较阴性组患者生存期短（P=0.01）。CD44v6的表达在组织学分级3～4级组、有淋巴结转移组、TNMⅡ～Ⅲa期组的阳性率较高（P<0.05）;肿瘤间质MVD在有淋巴结转移组、TNMⅡ～Ⅲa期组计数较高（P<0.05）。CD44v6、VEGF过表达及肿瘤间质MVD计数高组患者生存期较短（P<0.01）。结论 非小细胞肺癌MMP-2、CD44v6过表达及肿瘤间质MVD升高提示肿瘤患者预后差，三者有可能成为判断非小细胞肺癌生物学行为和临床预后的重要指标。
关键词 非小细胞肺癌 MMP-2 CD44v6 MVD 预后
Prognostic significance of the expression of MMP-2，CD44v6and tumor stroma microvascular density in non-small cell lung cancer
Yang Zhaorui，Hu Honghui，Zhang Xuemei，et al.
Department of Pathology，The First People’s Hospital Affiliated to Shanghai Traffic University，Shanghai200080.
【Abstract】 Objective The relationship was studied between the results of immunohistochemistry for MMP-2，CD44v6，tumor stroma microvascular density（MVD）and the clinical features or patient’s survival time in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods Immunohistochemistry for MMP-2，CD44v6，and CD34was performed from formalin-fixed paraffin-embedded tissue of73cases with following up data of NSCLC.The tumor stroma miˉcrovascular marked by CD34was also counted.Results In NSCLC，the positive rates of MMP-2expression were higher in the adenocarcinoma group and in the group with lymph node metastasis than that in the squamouscarcinoma and in the group without lymph node metastasisP<0.05）.MMP-2expression positive rate was higher in the group with lymph node metastasis than thatP<0.05）.MVD was higher in MMP-2positive group than that in negative one（P<0.05）.The positive rates of CD44v6were higher in the groups of tumor histological grade3～4and lymph node metastasis and TNM stageⅡ～Ⅲa（P<0.05）.The tumor stroma MVD was higher in the lymph node metastasis and TNM stageⅡ～Ⅲa groups（P<0.05）.Especially，the mean of the patient survival time after operation was shorter in MMP-2or CD44v6expression positive and MVD higher counter groups than that in the opposite group（P<0.01）.Conclusion MMP-2，CD44v6positive expression and higher MVD in NSCLC suggest that the patient prognosis is poorer.They may be the important marker of estimating NSCLC biological behavior and the patient’s progˉnosis.Key words NSCLC MMP-2 CD44v6 MVD prognosis
基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是基质降解代谢的重要酶类。MMP-2是MMPs的一员，能促进细胞外基质和基膜的降解，在肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。CD44v6在介导细胞-细胞或细胞-细胞外基质的粘附，保持组织正常形态结构的机制中起重要作用。CD44v6的表达与许多恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关。实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成。微血管密度（Microvascular density，MVD）是衡量肿瘤血管生成活性的量化指标。本文拟观察非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中MMP-2、CD44v6的表达和肿瘤间质微血管密度，探讨上述指标与非小细胞肺癌浸润、转移和预后的关系。
1 材料与方法
1.1 标本采集 收集上海交通大学附属第一人民医院1997～1999年资料完整并有随访结果的肺癌根治术标本73例，全部病例经术后病理证实为Ⅰ～Ⅲa期非小细胞肺癌。男55例，女18例，男女之比为3.1∶1;平均年龄63岁（40～79岁）;肿瘤直径1.5～7.5cm，平均4.35cm。至2002年10月末次随访，结果存活24例，死亡49例。患者术前均未接受过抗肿瘤化疗。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm厚切片。
1.2 组织学分类及肿瘤分期 组织分型依照WHO（1981 年）标准分型，分期按1992年国际抗癌协会（UICC）制定的标准。其中鳞状细胞癌36例，腺癌23例，腺鳞癌8例，细支气管肺泡癌6例。Ⅰ期25例，Ⅱ期18例，Ⅲa期30例。组织学恶性度分级:1～2级43例，3～4级30例。
1.3 试剂 MMP-2、CD44v6、单克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，CD34单克隆抗体购自DAKO公司。
1.4 免疫组化染色 采用S-P法。具体操作按说明书染色步骤进行，DAB显色，苏木精对比染色，常规封固。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.5 结果判定 以细胞膜和细胞质出现明显棕黄色颗粒为MMP-2或CD44v6阳性细胞，根据阳性细胞占同类细胞的比例将结果分为4个等级:阳性细胞<5%的反应为 （-），阳性细胞5%～25%的反应为（+），阳性细胞25%～50%的为（++），阳性细胞50%～100%的为（+++）。微血管计数采用显微镜100×视野下观察肿瘤间质CD34染色阳性血管，筛选血管生成最活跃区域，择取4个非重复200×视野下计数微血管数目，据此计算微血管密度，即计算每平方毫米的微血管数量（MVD）。
1.6 统计学方法 应用SPSS软件包，根据数据类型分别采用方差分析、χ 2 检查和相关分析。
2 结果
2.1 非小细胞肺癌临床病理特征与MMP-2、CD44v6表达及肿瘤间质MVD的关系 见表1。
表1 非小细胞肺癌临床特征与MMP-2、CD44v6表达及肿瘤间质MVD的关系（略）
2.1.1 MMP-2表达结果 癌细胞胞质内表达，部分癌细胞核亦有表达，呈棕褐色细颗粒状（见图1）。MMP-2在鳞状细胞癌组织中分化较好的成分如棘细胞样及角化细胞表达明显，分化较差的成分无表达或弱表达。部分癌旁组织中胶原纤维表达，部分小支气管壁软骨呈灶状表达。腺癌组的阳性表达率较鳞癌组的高（P=0.03）;淋巴结转移组的阳性表达率较无转移组的高（P=0.001）。MMP-2阳性表达组患者平均生存期较阴性组患者平均生存期短（P= 0.01）。MMP-2表达率与患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、组织学恶性度分级等组内差异无显著性。
2.1.2 CD44v6表达结果 正常支气管粘膜上皮的基底细胞表达，而柱状上皮细胞和粘液上皮细胞不表达。部分病例中增生的肺泡Ⅱ型上皮细胞亦有表达。在鳞状细胞癌胞质内表达均匀，显示较明显棕褐色细颗粒（见图2），分化差的细胞呈过表达，而分化好的细胞如棘细胞样癌细胞及角化株周围的癌细胞无表达。CD44v6在腺癌细胞质中染色较淡;腺鳞癌主要在鳞癌成分中表达，肺泡细胞癌仅有1例（1/6）弱阳性表达。男性较女性CD44v6的阳性表达率高（P<0.05），TNM分期中Ⅱ～Ⅲ期较之Ⅰ期病例的阳性表达率高（P<0.05），组织学分级中高级别组较低级别组的阳性表达率高（P<0.05），有淋巴结转移组较无淋巴结转移组的阳性表达率高（P<0.05）。年龄较长组、肿瘤较大组、鳞癌组织与腺癌相比的阳性表达率较高，但差异无显著性。
2.1.3 肿瘤间质微血管密度检测结果 以CD34标记肿瘤间质新生毛细血管内皮结果显示肿瘤中心微血管分布不均匀，纤维组织增生明显者微血管密度低，肿瘤细胞丰富者间质胶原纤维少，主要为丰富的毛细血管网。肿瘤组织与正常组织交界区微血管增生明显，伴随淋巴细胞、组织细胞等炎症细胞浸润。肿瘤中心微血管计数9～108条/mm 2 ，平均 26.38条/mm 2 ，中位数是25条/mm 2 。
2.2 非小细胞肺癌CD44v6、VEGF表达及肿瘤间质MVD与生存期关系 见表2。非小细胞肺癌CD44v6阳性表达组患者平均生存时间较阴性组平均生存时间短（P<0.001）;VEGF阳性表达组患者平均生存时间较阴性组平均生存时间短（P<0.001）;CD44v6和VEGF同时表达阳性组患者平均生存时间较阴性组平均生存时间明显缩短（P<0.001）;肿瘤间质MVD>25条/mm 2 组患者较≤25条/mm 2 组患者生存时间短（P<0.005）。
2.3 MMP-2、CD44v6与肿瘤间质MVD关系 见表3。MMP-2表达阳性组肿瘤间质MVD高于阴性表达组（P=0.019）。CD44v6阳性表达组肿瘤间质MVD虽比阴性组高，但差异无显著性（P=0.089）。
表2 MMP-2、CD44v6、MVD及淋巴结转移与生存期关系（略）
表3 MMP-2和CD44v6与肿瘤间质MVD关系（略）
3 讨论
恶性肿瘤细胞的特点是侵袭外周组织，在远隔器官形成转移肿瘤。Liotta等提出了肿瘤浸润三步学说:粘附、降解与移动 ［1］ 。指出肿瘤浸润与细胞外基质有密切关系。MMP-2是一种分子量为7.2×10 4 U的Ⅳ型胶原酶或明胶酶，由肿瘤细胞和间质细胞以酶原形式分泌，经水解后激活，能特异性的降解基膜的主要成分—Ⅳ型胶原，同时通过对细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管的形成，有利于肿瘤的生长、侵袭和转移。本研究发现非小细胞肺癌淋巴结转移组MMP-2表达阳性率高于阴性组（P=0.001），与相关的研究文献结果类似 ［2～4］ 。表明MMP-2是一种促进肿瘤浸润、转移的蛋白水解酶，其表达量的增加，使得原本均匀、稳定的基膜和细胞外基质结构被降解破坏，为肿瘤细胞的移动提供了有利的间质结构。肿瘤局部基膜的破坏，血管内皮细胞开始增生乃至血管网的形成过程都与MMP-2的表达及Ⅳ型胶原的降解密切相关，MMP-2对间质血管新生具有正向调节作用 ［5］ 。本研究结果显示MMP-2阳性表达率高的肿瘤间质MVD亦高（P=0.019），验证了MMP-2对微血管增生的促进作用。这可能是通过一些细胞外因子的作用，将肿瘤实质细胞、间质细胞和MMP-2的产生有机结合起来，使MMP-2在间质中的表达受到肿瘤实质细胞的调节控制，而实质细胞的增生、浸润、转移又受到间质血管新生的促进 ［6］ 。
恶性肿瘤细胞又一生物学特征是细胞与细胞之间，细胞与间质之间粘附性的异常，这种粘附性的异常导致肿瘤细胞具有了从原发部位脱落并向周围正常组织侵袭的能力，CD44v6的出现改变了肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能，使肿瘤细胞侵袭和转移的能力增强 ［7］ 。
正常肺组织支气管粘膜上皮的基底细胞、鳞状化生的细胞和Ⅱ型肺泡上皮CD44v6表达阳性，可能与上皮修复、再生和非小细胞肺癌的组织发生有关 ［8］ 。小细胞肺癌不表达CD44v6，非小细胞肺癌CD44v6表达阳性，鳞癌表达高于腺癌 ［9］ 。但也有学者认为CD44v6表达与非小细胞肺癌淋巴结转移和临床分期无关 ［10］。本文发现非小细胞肺癌淋巴结转移组、临床TNMⅡ-Ⅲ期患者和高级别组织学分级的肿瘤CD44v6阳性表达率高于无淋巴结转移组、临床TNMⅠ期患者和低级别组织学分级组的肿瘤P<0.01），与文献报道的相同。男性患者组肿瘤CD44v6阳性表达率高于女性患者组（P=0.006），不同于以往文献报道，这可能由于本组患者肿瘤腺癌、肺泡细胞癌构成比较大的缘故（10/18），而腺癌、肺泡细胞癌的CD44v6阳性表达率较低。
进一步检测MMP-2、CD44v6和MVD与患者生存期关系时发现，MMP-2、CD44v6阳性表达组和肿瘤间质MVD高值组患者生存期更短（P≤0.01）。MMP-2和CD44v6同时表达阳性组患者平均生存时间较阴性表达或仅为一项表达阳性组的平均生存时间明显缩短（P=0.000）。提示MMP -2、CD44v6和MVD与非小细胞肺癌患者生存期密切相关。MMP-2、CD44v6表达阳性预示患者术后生存时间较短，而二者同时表达阳性更加大了患者术后生存的风险。肿瘤间质MVD>25条/mm 2 者平均生存时间几乎仅为MVD≤25条/mm 2 患者平均生存时间的一半，提示肿瘤间质MVD高者预后较差。
淋巴结转移、TNM分期和组织学分级是影响肺癌预后的主要因素，本研究表明MMP-2、CD44v6表达以及肿瘤间质MVD>25条/mm 2 时与非小细胞肺癌淋巴结转移、TNM分期密切相关，尤其是上述指标与患者术后生存期密切相关。故认为MMP-2、CD44v6和肿瘤间质MVD可作为判断非小细胞肺癌患者预后的生物学指标，联合检测非小细胞肺癌组织中MMP-2、CD44v6和肿瘤间质MVD对指导临床治疗及判断预后具有较实用的参考价值。
（本文图片见封三） （略）
参考文献
1 Liotta LA.Tumor invasion and metastasis role of extracellular matrix.Cancer Res，1986，46（1）:1-7.
2 范松青，魏启动，李美容，等.MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2在乳腺癌的表达及临床意义.诊断病理学杂志，2003，10（2）:99-101.
3 Massi D，Franchi A，Ketabchi S，et al.Expression and prognostic signifiˉcance of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in primary neuroendocrine carcinoma of the skin.Hum Pathol，2003，34（1）:80-88.
4 王璐，李玉林，张丽红，等.MMP-9在胃癌组织中的表达及对血管新生和肿瘤进展的影响.临床与实验病理学杂志，2002，18（2）:163-166.
5 Comelius LA，Nehring LC，Rody JD，et al.Human dermal microvascular endothelial cells produce matrix metalloproteinases in response to angioˉgenic factors and migration.J Invest Dermatol，1995，105（2）:170-176.
6 Stearns ME，Rhim J，WangM.Interleukin10（IL-10）inhibition of priˉmary human prostate cell-induced angiogenesis;IL-10stimulation of tissue inhibitor metalloproteinase-1and inhibition of matrixmetalloproˉteinase（MMP）-2/MMP-9secretion.Clin Cancer Res，1999，5（1）:189-196.
7 Bourrguignon LY，Lida N，Welsh CF，et al.Involvement of CD44and its variant isoforms in membrane-cytoskeleton interaction cell adhesion and tumor metastasis.J Neuro Oncol，1995，26（3）:201-208.
8 Fasano M，Sabatino MT，Wieczorek R，et al.CD44and its v6spliced variant in lung tumors:a role in histogenesis.Cancer，1997，80（1）:34-41.
9 赵惠儒，方军，杜光烨，等.CD44在肺癌中表达的临床研究.中华结核和呼吸杂志，1998，21（9）:541-543.
10 Nguyen VN，Mirejovsky T，Melinova L，et al.CD44and its v6spliced variant in lung carcinomas:relation to NCAM，CEA，EMA and UP1and prognostic significance.Neoplasma，2000，47（6）:400-408.
（收稿日期:2004-07-03）
（编辑秋 实）
作者单位:200080上海交通大学附属第一人民医院病理科