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Specific MAP antigen for detecting anti-HVR1 in HCV infectious serum
WANG Yonggang, HAO Fei, HUANG Yanping, et al.
Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical College, Chongqing 400038, China
【Abstract】Objectives To develop a new method for detecting the antibody corresponding to hypervariable region 1 (HVR1) in HCV infectious sera and explore the relation of anti-HVR1 to viremia. Methods Using linear epitope peptides (represented by LP) and MAP (symmetric 8 branches ) derived from 22 amino acids (position 390aa～411aa ) of HCV-BJ HVR1 as the coated antigen respectively ,we established the ELISA methods to detect anti-HVR1 in sera,and evaluated its clinical significance with the measurement of HCVRNA in some of the sera.Results The rates of anti-LP and anti-MAP detection in 59 anti-HCV2.0 positive sera were 29% and 58% respectively,and there was a more significant difference (P＜0.0001) of mean OD450 between anti-MAP (
【Key words】Hepatitis C-like viruses;Genes, structural, viral;Hepatitis C antibodies
近年来的研究表明，丙型肝炎(丙肝)病毒（HCV）基因E2-NS1的高变区(HVR)1上含有重要的中和抗原表位，编码的蛋白能诱导机体产生中和抗体［1，2］；但由于HVR1序列的高度变异性，国内及国外的第1～3代诊断试剂均未使用E2-NS1区抗原。我们利用可形成构型表位的多抗原肽（MAP）为手段，以间接酶联免疫吸附测定（ELISA）法，检测肝炎患者血清中抗HVR1抗体，结合HCV RNA检出情况，对其意义进行了初步探讨。
材料和方法
一、血清及来源
1.丙肝病毒抗体(抗HCV)阳性血清：共59份，其中本院住院及门诊患者血清28份，献血者血清12份，郑州地区解放军第一五三中心医院住院患者血清19份。全部血清分装置-20℃冻存，一次性检测。所有血清均经抗HCV第2代ELISA试剂盒(Chiron公司重组HCV抗原包被）检测证实。
2.甲、乙、丁、戊型肝炎患者血清：甲肝病毒抗体(抗HAV)IgM阳性血清15份；单纯乙肝表面抗体(抗HBs)阳性血清15份；乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)及乙肝核心抗体(抗HBc)均阳性血清15份；丁肝病毒抗体(抗HDV)总抗体阳性血清15份；戊肝病毒抗体(抗HEV) IgM阳性血清15份。均为未检出抗HCV的我科1996年12月～1997年12月住院患者血清。
3.对照血清：其中正常对照血清105份，均来自本院输血科健康献血者，并经检测排除甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒及艾滋病毒(HIV)感染，且肝功能正常。阳性对照血清1份，为HCV-BJ株感染者血清。
二、抗原的来源及其在HCV蛋白上的区段
根据我室已经获得的HCV-BJ株(1b型)E2-NS1区氨基酸序列，利用Goldkey软件(军事医学科学院提供），根据蛋白质结构和抗原性预测原理［3］，依靠计算机分别对其进行局部亲水性及主链柔韧性预测，并结合国外学者已报道的HCV HVR1序列上B细胞抗原表位区段，最后由美国Cybersyn生物工程公司合成所设计HCV-BJ株HVR1 390～411aa序列的线性表位多肽（LP）及对称8分支多抗原肽(MAP)。合成肽产品经高效液相色谱(HPLC)分析其纯度大于95％。
三、实验方法
1.血清抗HVR1检测［4］：采用间接ELISA法检测血清抗HVR1。分别以LP和MAP为抗原，按每孔2.5 μg包被96孔酶联板，并设置无抗原的空载体对照孔。血清标本按1∶20稀释，酶标二抗为1∶5 000的羊抗人IgG-HRP，显色底物为四甲基联苯胺(TMB)，最后在450 nm波长下测定吸光度值(A)。阳性截止值（cutoff值）为105份正常血清A450值的
2.常规HCV RNA检测：采用国产HCV套式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒，引物设计来自5′非编码区（5′NCR)序列，按说明书进行操作及结果判断，出现196 bp的cDNA片断为阳性。
3.LP与MAP反应原性差异的显著性检验：采用同总体单个连续变量的PDA-1软件进行t检验分析。抗LP、抗MAP与HCV RNA的关联性检验，采用配对分类变量的CTA-1软件进行χ2检验。
结果
1.受检59份抗HCV2.0阳性血清检出情况：59份血清中检出抗LP阳性17份(29%)，抗MAP阳性34份(58%)；而17份抗LP阳性血清仅1份未被MAP作为包被抗原检出，其余16份血清抗MAP亦为阳性(χ2=13.02，P＜0.001)，关联性有非常显著意义，说明LP与MAP的抗原性有非常明显的一致性。阳性血清抗LP及抗MAP的A450检测值分别为0.56和1.59；抗LP抗体的A450均值为
2.甲、乙、丁、戊型肝炎血清：75份血清中检出抗LP阳性6份，抗MAP阳性5份，其中有1份同时阳性。抗LP与抗MAP的平均A450值分别为0.172和0.204。对此10份血清进行HCV RNA检测，结果发现4例阳性，且均为抗MAP阳性标本（表1）。
表1 75份非丙肝患者血清抗HVR1阳性检出情况
| 患者 | 肝炎病毒阳性标志 | A450值 | HCV RNA | |
| 抗-LP | 抗-MAP | |||
|
P1 |
抗-HAV IgM | 0.05 | 0.27(+) | + |
| P2 | 抗-HAV IgM | 0.20(+) | 0.04 | - |
| P3 | 抗-HBs | 0.07 | 0.16(+) | + |
| P4 | 抗-HBs | 0.08 | 0.11(+) | - |
| P5 | HBsAg、HBeAg、抗HBc | 0.24(+) | 0.26(+) | + |
| P6 | 抗-HDV | 0.14(+) | 0.08 | - |
| P7 | 抗-HDV | 0.04 | 0.22(+) | + |
| P8 | 抗-HDV | 0.15(+) | 0.09 | - |
| P9 | 抗-HEV IgM | 0.17(+) | 0.05 | - |
| P10 | 抗-HEV IgM | 0.13(+) | 0.04 | - |
注:+ 表示阳性结果 3.抗HVR1与HCV RNA检出的关系：通过对HCV 5′NCR区扩增，在40份抗HCV阳性血清中，检出HCV RNA阳性23份(57.5%)，其中有9例抗LP阳性，18例抗MAP阳性，5份抗HVR1阴性血清亦检出了HCV RNA；经χ2检验，P均＞0.05，差异无显著意义，提示抗HVR1与HCV RNA无显著关联性。
讨论
自从1991年Hijikata等发现位于HCV E2-NS1 N末端的HVR1序列后，HCV HVR1的研究受到广泛重视。用重组HCV包膜糖蛋白及其人工合成肽作为抗原，检测肝炎患者血清中相应抗体的报道较多。由于所用抗原不同，抗E2阳性率亦不同，一般20％～97%不等，其检出率很大程度上受到抗原来源及检测方法的影响［5］，且涉及E区全区段；由于HVR1序列的高度变异性，针对抗HVR1的检测报道较少。Zibert等［1］发现HVR1合成肽针对其相应的同型HCV株感染者抗HVR1检出率为67%，而抗HCV阳性血清(60份)检出率仅为15%，因此认为抗HVR1的检出将受到病毒株特异性限制。我们采用HCV-BJ株HVR1合成肽为抗原，59份抗HCV阳性血清中，抗LP阳性17份(29%)，而抗MAP阳性34例(58%)，接近国外报道的同型株检出水平，两者反应性差异亦有非常显著意义，说明MAP与天然抗体的结合能力(反应原性）明显优于LP。另外，两者抗原性亦有很好的一致性，关联性分析P＜0.01，证实MAP不仅保持了LP相应的抗原表位性，而且显著提高了多肽与抗体反应的敏感性。
最近，国内学者王海林等［4］设计了HCV C区的MAP，研究后认为，常规LP抗原由于其分子量较小，抗原表位单一，因此固相免疫检测中它们与相应抗体反应敏感性和包被效率均受到很大限制。在本研究的预实验中，曾试着提高LP的包被浓度至每孔5μg或适当增加酶标二抗的浓度，但反应吸光度值并无明显改变（结果未显示）。另外，从75份其他型别肝炎患者血清中抗HVR1检测情况看，6例抗LP阳性血清中，仅有1例检出HCV RNA（此例抗MAP亦阳性），5例抗MAP阳性血清中就有4例检出HCV RNA，而这些血清用常规抗HCV第2代ELISA试剂盒并未发现抗HCV阳性，提示MAP可提高与天然抗体反应的特异性，亦可提高HCV感染者抗体反应检出率。因此，设计和合成HVR1区MAP，可望成为目前国内检测抗HVR1的包被抗原来源之一。
HCV HVR1含有病毒株特异的中和性抗原表位，但有关抗HVR1出现与病毒血症之间的关系尚无一致性结论。有报道，在无病毒血症患者(21例）血清中未检出抗HVR1，而病毒血症患者(121例）血清中抗HVR1检出率高达58%和32%（针对两种不同的HVR1序列的多肽抗原）［6］。由于HCV基因组中HVR1结构及功能的特殊性，多数学者认为，抗HVR1抗体在HCV急性感染后早期出现，意味着对病毒有清除作用，而晚期或慢性期出现，对阻止病毒感染作用不明显［7］。研究还发现，由于机体免疫选择压力等因素作用，慢性HCV感染者体内可同时存在多种不同HVR1序列的相似株病毒群体，从而增加了抗HVR1与病毒血症间关系的复杂性［8］。我们的研究发现，抗LP和抗MAP检出与病毒血症出现无显著关联性。不过由于本试验中所选择的抗HCV阳性血清来自不同人群，涉及多个地区及医疗单位，临床相关资料不全，且未作动态观察，很难就抗HVR1检出的意义作出评价，相关的研究将在以后试验中进一步探讨。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670672)
通信作者：王永刚，100039 北京，解放军第三○二医院感染三科
参考文献
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4 王海林，颜子颖，夏宁邵，等.利用合成肽进行丙型肝炎病毒(HCV)的线性抗原表位分析.生物化学杂志，1996，12:418-422.
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6 Scarselli E, Cerino A, Esposito G, et al. Occurrence of antibodies reactive with more than one variant of the putative envelope glycoprotein (gp70) hypervariable region 1 in viremic hepatitis C virus-infected patients. J Virol, 1995,69:4407-4412.
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