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Fas和β-雌二醇受体融合基因在COS-7细胞中的表达
免疫学杂志 1999年第1期第0卷 基础免疫学
作者：孙 蕾1 王会信1 周廷冲1
单位：军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850
关键词：融合基因 序列分析 转染 免疫印迹
摘 要 设计三条引物P1、P2、P3扩增全长hFas基因和只含有跨膜区和胞浆区的mFas基因。P2上设计一个BstXI位点，以与hFas信号肽之后的单酶切位点BstXI连接，获得带信号肽的跨膜区和胞浆区SpmFas基因。另外设计两条引物P4、P5扩增人β-雌二醇受体的激素结合结构域。扩增基因均经DNA序列分析得到证实。Ρ3、P4均设计了Kpn I位点，用于两基因融合，并将此融合基因插入真核表达载体pcDNA3。脂质体法转入COS-7细胞进行瞬时表达，Western Blot检测到约57KDa的表达产物，与融合基因的估算分子量相符。
中图号 Q78
EXPRESSION OF FAS／ESTROGEN RECEPTOR FUSION GENE IN COS-7 CELLS
Sun Lei， Wang Huixin， Zhou Tingchong
（Institute of Beijing Basic Medical Sciences， Beijing 100850）
Abstract Three primers P1、P2、P3 were used to amplify the whole sequence and the transmembrane and cytoplasma fraction of hFas by PCR． A BstX I site was designed in P2 to ligate with the BstX I site downstream hFas signal peptide to obtain SpmFas． Other two primers P4、P5 were used to PCR-amplify the hormone-binding domain of human β-estrogen receptor． All amplified fragments were verified by sequencing analysis． The two genes were fused at Kpn I site designed in both P3 and P4 and then the fusion gene was inserted into pcDNAs．Using lipofectamine-mediated gene transfer technique， the fusion gene was tranduced into COS-7 cells and a 57DKa expression band which is in agreement with the calculated Mr was detected by Westen blot analysis．
Key words Fusion gene，Sequencing analysis，Transfection， Western blot
1989年，Yonehara［1］分离出一株对多种细胞具有杀伤活性的单抗，并把这个单抗所识别的细胞表面抗原定名为Fas。Fas介导的凋亡与TNFα非常相似。同源比较发现，Fas胞浆区一个68aa的结构域与TNF-R1胞浆区一个80aa的结构域，有较弱的同源性，是介导凋亡的功能区，定义为“死亡结构域”（“Death Domain”，简称DD［2］）。DD在结构和功能上独立，具有“自我聚集”功能，去掉胞外区的突变体在细胞中过表达，也可诱导凋亡［3］。
β-雌二醇受体（Εstrogen receptor，简称ER）是一个核受体，与其他核受体（甲状腺激素受体、视黄酸受体、VD3受体）一样，含有两个重要结构域：DNA结合域和激素结合域（Hormone-binding domain，简称HBD）。无激素时，HBD与胞浆hsp90结合，可对与它处于同一条多肽链上的其他结构域的活性产生抑制作用；HBD结合激素后，hsp90解离，抑制作用解除［4］。利用HBD的特性，已将许多癌蛋白、转录因子、激酶与之融合，建立激素调控型细胞模型，以研究细胞的功能［5，6］。本文采用基因重组技术，将Fas的跨膜区和胞浆区与HBD融合，并在COS-7细胞中获得瞬时表达，从而为下一步转染肿瘤细胞建立一种激素诱导的可调控型的细胞凋亡模型打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、质粒和细胞：E．coli DH5α受体菌，本室保存。质粒pMV7-mycER由德国ZMBH的Martin Eilers教授惠赠，带有c-myc和ER的融合基因。hFas cDNA由协和基础所郑德先教授惠赠。COS-7细胞，本室保存。
1.1.2 工具酶和主要试剂：限制性内切酶、修饰酶、PCR试剂（Promega）；PCR引物（上海生工公司）；［α-32P］dCTP（北京亚辉生物医学工程公司）；测序试剂盒T7-Sequencing Kit（Pharmacia-LKB）；Western Blot试剂（北京中山生物技术有限公司）；抗人ER的抗体（Santa Cruz）；Lipofectamine（Gibco BRL）。细胞裂解缓冲液： 50mmol／L Tris．Cl pH 8．0，150mmol／L NaCl，0．02％ NaN3，0．1％ SDS， 100μg／ml PMSF，1％ NP-40，0．5％ sodium deoxycholate，1μg／ml Aprotinin
1．2 方法
1.2.1 PCR引物设计：hFas引物P1的5′端设计EcoR I位点，P3的5′端设计Kpn I位点；ER引物P4的5′端设计Kpn I位点，P5的5′端设计Xho I位点。两基因通过Kpn I融合，融合后的基因通过EcoR I、Xho I插入高效真核表达载体pcDNA3。hFas信号肽下游第16位aa［5］处有一Bst XI位点，通过此位点可将信号肽后的序列切除。因此在hFas跨膜区上游的第144位aa［5］处设计一带有BstXI位点的引物P2，利用P2、P3扩增出的mFas基因片断可通过Bst XI位点与信号肽连接。另外在两基因的融合区上游设计一引物P6，以证明融合区的相位是否正确。这6条引物分别是：
| P1： | 5′… | G | GAATTC | ACC | ATG | CTG | GGC | ATC | TGG | ACC | CTC…3′ |
| CTC | EcoRI | ||||||||||
| P2： | 5′… | G | GAATTCCAAGGGAGTGG | AA | ACC | AGC | AAC | ACC | TGC | TGC…3′ | |
| EcoRI BstXI | |||||||||||
| P3： | 5′… | GG | GGTACC | GGA | CAA | GCT | TTG | GAT | TTC | A…3′ | |
| KpnI | |||||||||||
| P4： | 5′… | G | GGGTACC | ATT | GGA | TCT | GCT | GGA | GAC ATG | AG…3′ | |
| KpnI | |||||||||||
| P5： | 5′… | G | GAATTCTCGAG | CTA | GAC | TGT | GGC | AGG | GAA | AG…3′ | |
| EcoRI XhoI | stop | ||||||||||
| P6： | 5′… | CTT | TGT | ACT | CTT | GCT | GAG…3′ |
1.2 .2 PCR扩增条件：质粒模板95°C变性3min，进入循环；94°C变性1min，58°C退火1min， 72°C延伸1min。经25次循环后，72°C充分延伸5min。
1.2.3 基因操作：参照文献［6］。
1.2.4 DNA序列分析：见T7 Sequencing Kit说明书。
1.2.5 COS-7细胞转染：见Lipofectamine使用说明书。
1.2.6 Western Blot：收集转染后60h的COS-7细胞，冰预冷却PBS洗两遍，加入裂解缓冲液，冰上孵育30min，细胞刮刀刮下，移入Eppendof管中，超声破碎2min，4°C 12 000g离心2min。取上清进行SDS-PAGE和Western Blot。2 结果
2.1 目的基因的PCR扩增 经过25次循环后，扩增出1 005bp的全长hFas基因，528bp的mFas以及942bp的HBD基因片断，结果见图1。
图1 PCR扩增结果
Fig 1 PCR amplification
1：HBD
2：hFas
3：mFas
4：λDNA／HindⅢ Marker
2．2 带信号肽的SpmFas基因的构建和序列分析 hFas PCR产物纯化后，经EcoRI、Kpn I酶切，插入pUC18，然后用BstXI、KpnI将信号肽以后序列切除，并与经BstXI、KpnI酶切的mFas PCR产物连接，得到重组质粒pUC-SpmFas。质粒的酶切鉴定结果见图2。用pUC18的正反向引物对pUC-SpmFas测序的结果见图3。
图2 序列分析的结果
Fig 2 Sequencing analysis
1、2：SpmFas forward
3、5：HBD forward
4、6：SpmFas reverse
7、8：HBD reverse
9：sequence of the fusion region
2.3 pUC-HBD的构建和序列分析 HBD PCR产物纯化后，经EcoR I、Kpn I酶切，插入pUC18， 得到重组质粒pUC-HBD。质粒的酶切鉴定结果及用pUC18正反向引物对其测序的结果见图3。
图3 酶切分析结果
Fig 3 Enzyme digestion analysis
1： pUC-HBD／Kpn I＋Xho I
2： pUC-SpmFas／EcoRI＋KpnI
3： pFasER／EcoR I＋Xho I
4： λDNA／HindⅢ Marker
2.4 融合基因表达质粒pFasER的构建和融合区序列分析 用EcoRI、KpnI从pUC-SpmFas中切下Sp-Mfas基因片段，回收，用KpnI和XhoI从pUC-HBD中切下HBD基因片段，回收。SpmFas基因片断；用Kpn I、Xho I从pUC-HBD中切下HBD基因片断；pcDNA3用EcoRI、Xhol双酶切，回收载体片段。3片段连接、转化，获得重组表达质粒pFasER。质粒的酶切鉴定结果见图2。用引物P6对pFasER进行序列分析的结果表明，融合基因的相位完全正确。测序结果见图3。
2．5 Fas和ER融合基因在COS-7细胞中的表达 取重组质粒pFasER和对照空质粒pcDNA3各15μg与24μllipofectamine混合，转染2×106 COS-7细胞。60h后收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE和Western Blot。转染pFasER的COS-7细胞裂解物在大约57KDa处有一表达带，与融合基因的估算分子量相符。对照转染空质粒pcDNA3的COS-7细胞则没有表达带，免疫印迹结果见图4。
图4 免疫印迹结果
Fig 4 Western Blot analysis
1，2：cell lysis of COS-7 cells transfected with pFasER
3：cell lysis of COS-7 cells transfected with pcDNA3
3 讨论
“DD”诱导凋亡的机理不很清楚，Fas的胞浆区不具有任何酶活性，它通过与细胞膜附近的信号分子相互作用来传递死亡信号。因此Fas在细胞膜上的定位很重要。我们通过PCR手段，将Fas的胞外区缺失，而保留其自身信号肽，获得带有信号肽的跨膜区和胞浆区Fas基因，然后又与β-雌二醇受体的HBD融合。融合基因的一个重要特点是，所表达的融合蛋白的两部分在结构上应保持各自的天然构像。β-雌二醇受体的DBD和HBD之间的aa起着绞链作用，小的缺失或插入对其功能没有多大影响［4］。我们在进行基因融合时，利用了这段铰链区，以保证融合后的两蛋白仍保持其原有的结构和活性。
第一作者：女，28岁，博士
参考文献
［1］ Yonehara S，Lshii A，Yonehara M，et al． A cell killing monoclonal antibody（anti-fas ） to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor． J Exp Med， 1989，169：1747
［2］ Itoh N，Nagata S．A novel protein domain required for apoptosis． J Biol Chem， 1993，268：10932
［3］ Mark PB，Igor LM，Eugene EV，et al． Self-association of the “Death Domain” of the p55 tumor necrosis factor （TNF） receptor and Fas／Apol prompts signalling for TNF and Fas／Ap01 effects． J Biol Chem， 1995，270：337
［4］ Picard D，Salser SJ，Yamamoto KP．A movable and regulable inactivation function within the steroid binding domain of the glucocorticoid receptor． Cell， 1988，54：1073
［5］ Itoh N，Yonehara S，Ishii A，et al． The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis． Cell， 1991，66；233
［6］ Sambrook J，Fritisch EF，Maniatis T．Molecular Cloning．A Laboratory Manual， 2nd ed， 1989
（1998-03-23收稿；1998-07-12修回）