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CKIs蛋白在视黄酸诱导HL-60细胞分化中的作用研究
免疫学杂志 1999年第1期第0卷 基础免疫学
作者：糜漫天1 张乾勇1 朗海滨1 杨志祥1 韦 娜1
单位：第三军医大学营养卫生学教研室 重庆 400038
关键词：视黄酸 细胞周期素依赖激酶抑制物 细胞分化
摘 要 从细胞周期调控这一途径探讨视黄酸抑制细胞增殖、诱导细胞分化的分子机制。结果显示：5×10－6mol／L全反式视黄酸（ATRA）及芳维甲（AE）处理的HL-60细胞生长受抑，4d后90％细胞停滞于G0／G1期，G1→S期转换受阻，同时NBT还原反应增强，Western Blot分析及免疫细胞化学染色表明处理后的细胞p16、p21两种细胞周期素依赖激酶抑制物（CKIs）表达增加，而CyclinD1和pRb蛋白则降低，其中尤以ATRA作用为明显。结果提示，细胞周期调控相关蛋白可能在视黄酸及其衍生物抑制细胞增殖、诱导细胞分化过程中起重要作用。
中图号 R730．2
ROLE OF CKIs PROTEIN IN THE DIFFERENTIATION OF HL-60 CELL INDUCED BY RETINOIC ACID
Mi Mantian，Zhang Qianyong，Lang Haibin，Yang Zhixiang，Wei Na
（Department of Nutrition and Food Hygiene，Third Military Medical University，Chongqing 400038）
Abstract In this report，the molecular mechanism of cellular proliferation inhibition and differentiation induced by retinoic acid was studied from the aspect of cell cycle control．The result showed，that 5×10－6mol／L all tran retinoic acid（ATRA）or arotinoidethylester（AE）could inhibit HL-60 cell growth and induce the cells differentiation，90 percent cells was arrested at G0／G1 phase after 4 days treatment of ATRA or AE，and the transition from G1 to S phase was blocked the expressions of p16 and p21 proteins，two kinds of cyclin dependent kinase inhibitors（CKIs），increased，but cyclinD1 and pRb proteins，the key regulators of G1→S phase transition，decreased．These results suggest that cell cycle relative proteins may play an important role in the control of cell proliferation inhibition and differentiation induced by retinoic acid and its derivatives．
Key words Retinoic acid，Cyclin dependent kinase inhibitors，Cell differentiation
视黄酸（Retinoic acid，RA）及其衍生物对多种肿瘤细胞具有增殖抑制和诱导分化作用，其中以对HL-60细胞的作用较为突出，但目前有关RA及其衍生物诱导细胞分化的分子机制仍不清楚。近年来，有关细胞周期调控分子机制的研究已有较大进展，比较一致的看法是细胞周期进程受一系列正和负信号的调节，细胞周期素（cyclins）、细胞周期素依赖性激酶（CDKs）、细胞周期素依赖性激酶抑制剂（CKIs）、p53、pRb蛋白以及某些癌基因的表达产物相互构成一个调控网络［1］，此调控网络中的相关成分不但控制着细胞周期进程，同时也直接与细胞增殖与分化的调节相关联。上述调节信号的扰乱可能与以细胞恶性增殖为特征的生长失控、细胞低分化有重要联系［2］。本研究重点观察了全反式视黄酸（ATRA）及第三代视黄酸衍生物芳维甲（AE）对HL-60细胞细胞周期调控蛋白cyclinD1、p16、p21及抑癌基因表达产物pRb的影响，旨在深入探讨RA抑制细胞增殖、诱导细胞分化的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 HL-60细胞株（人早幼粒白血病细胞）由北京医科大学血液病研究所提供，全反式视黄酸（All-tran retinoic acid，ATRA）为Sigma公司产物，芳香型维甲乙酯（简称芳维甲，Arotinoid ethylester，AE）由本校新桥医院皮肤科何威博士提供，鼠抗CyclinD1、兔抗pRb、兔抗p16INK4a、兔抗p21等单抗为Santa cruz公司产品，SP试剂盒为Zymed公司产品、PVDF膜和化学发光检测试剂盒为美国杜邦公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞株的培养及处理：HL-60细胞在含10％热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养传代。ATRA和AE分别溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成5×10－3mol／L储存液置－20°C冰箱，处理细胞终浓度为5×10－6mol／L，对照组培养液中仅加相应量的DMSO（0．1％）。
1.2.2 细胞周期分析：经ATRA和AE处理1～4d的HL-60细胞、碘化丙啶染色后用流式细胞仪（FCM）对DNA进行定量分析，再结合计算机软件推算出各细胞周期相细胞所占比例。
1.2.3 细胞分化实验：NBT还原反应参照Kiziki等人的方法［3］。
1.2.4 Western blot分析：1×107个经ATRA和AE分别处理不同时相的HL-60细胞中加入100 μl 1％ NP-40细胞裂解液（50mmol／L Tris，150mmol／L NaCl，1％ NP-40，5mmol／L NaF，5mmol／L Na3VO4，5mmol／L Na4P2O7，0．1％ SDS，1mmol／L PMSF，10 μg／ml Leupetin，10 μg／ml Aprotinin），冰浴 30min、4°C 12 000g×2min，上清保存于－20°C备用（为蛋白质粗提物）；参照《分子克隆》第2版［4］，取细胞蛋白粗提物20 μl经10％ SDS-PAGE电泳后，用电转移转膜，1％ BSA 37°C封闭1h或4°C封阻过夜，加一抗，37°C孵育1h，再与生物素标记二抗及链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物37°C反应1h，最后再用化学发光检测试剂盒检测相应蛋白带。
1.2.5 免疫细胞化学染色：参见文献方法［5］。细胞经固定、封闭后加一抗37°C孵育1h，再与生物素标记的二抗及链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物反应，常规DAB显色。阴性对照是用正常兔血清代替一抗进行免疫细胞化学染色。
2 结果
2.1 ATRA和AE对HL-60细胞的增殖抑制及诱导分化作用 图1显示，5×10－6mol／L ATRA或AE处理的HL-60细胞，G0／G1期细胞增多，处理4d后，约90％细胞受阻于G0／G1期，而对照组细胞则有50％处于S期或G2／M期；另外ATRA或AE处理4d细胞NBT还原能力显著增强（见表1），上述结果表明：ATRA和AE均能抑制HL-60细胞增殖，将细胞停滞于G0／G1期，并诱导其向粒细胞分化。
图1 ATRA或AE处理HL-60细胞G0／G1期细胞分布
Fig 1 The relative percentages of G0／G1 phase cells after exposure to ATRA or AE
表1ATRA和AE对HL-60细胞分化能力的影响
Tab 1Effects of ATRA and AE on differentiation of
HL-60 cells
| Groups | NBT＋（％） | O．D value |
| Control | 4．3±0．5 | 0．037±0．002 |
| ATRA | 61．0±2．6* | 0．163±0．010* |
| AE | 8．6±2．6* | 0．107±0．005* |
| *P＜0．01 compared with the cntrol
2.2 ATRA和AE对HL-60细胞p16、p21及pRb蛋白表达的影响 免疫印迹分析显示（见图2），5×10－6mol／L ATRA或AE能上调CDKs抑制物p16、p21蛋白表达，其中以ATRA作用明显，处理HL-60细胞1d后即可见p16、p21蛋白表达明显增加；另外发现ATRA和AE处理后的HL-60细胞抑癌基RB表达产物pRb蛋白明显降低，尤其是在处理2d后，这种变化较为显著。 |
图2 ATRA 和AE对CDKs抑制物p16、p21及pRb蛋白表达的影响
Fig 2 The effects of ATRA and AE on the expression of CDKs inhibitors p16、p21 and pRb proteins
2.3 ATRA对CyclinD1蛋白表达的影响 免疫细胞化学染色结果显示（见图3，图4），HL-60细胞中CyclinD1蛋白表达较高，阳性反应产物主要集中在细胞核，细胞质中也弥散着少许。经ATRA处理3d后，HL-60细胞CyclinD1表达明显减少，细胞阳性着色反应浅淡。
图3 未处理HL-60细胞CyclinD免疫细胞化学染色（×400）
Fig 3 The result of CyclinD ICC-stain in untreated HL-60 cells（×400）
图4 ATRA处理3d HL-60细胞CyclinD免疫细胞化学染色（×400）
Fig 4 The result of CyclinD ICC-stain in HL-60 cells of 3d treatment by ATRA（×400）
3 讨论
在哺乳动物细胞中，Cyclins和CDKs形成的二聚体复合物为细胞周期调节的核心，近来的研究显示，这一机制还涉及到CDK抑制物（CKIs）、某些癌基因及抑制基因的表达产物（如p53、c-myc和pRb蛋白等），它们的相互作用可在多个层次上对细胞周期进程进行精密的调控。细胞由G1→S→G2→M期的转换过程中存在着几个限制点（check point）、CyclinD／CDK4复合物被认为是G1→S期转换最重要的调控子［6］。有研究证实，CDK2和CDK4激酶活性的降低将导致细胞受阻于G0／G1期，CDKs表达及其活性的下调是许多种类细胞终末分化的关键事件［7］，提示细胞周期调控蛋白不仅调控着细胞的增殖分裂，同时也与细胞分化成熟密切相关。
本研究显示，5×10－6mol／L ATRA或AE处理的HL-60细胞生长明显受抑，4d后90％细胞停滞于G0／G1期，同时NBT还原反应增强，表明HL-60细胞G1→S期转换受阻，细胞分化能力增强；Westeron Blot分析及免疫细胞化学染色显示，ATRA或AE处理的细胞，p16和p21两种CKIs表达明显增加，而CyclinD1及pRb蛋白表达降低，其中尤以ATRA作用为明显。
已知p21、p16等细胞周期依赖性激酶抑制物能与相应Cyclins／CDKs复合物结合并抑制其活性，尤其是p16对CDK4活性的抑制可使细胞停滞于G0／G1期，Dobashi的研究还显示，p21表达质粒转染的细胞生长受抑、并出现分化特征［8］，抑癌基因表达产物pRb蛋白目前被认为是调节细胞增殖和分化的开关，高磷酸化pRb刺激细胞增殖、低磷酸化的pRb则促进细胞分化，而pRb磷酸化又受CDKs催化。Wang等人的研究证实，在维生素D3和DMSO诱导细胞分化过程中，CDKs活性降低，p27和p21等CKIs表达增加［9］，且有人认为，不管是下调节Cyclins或CDKs的表达，还是上调节CKIs的表达，CDKs活性的降低是许多细胞向终末分化的共同事件。作者曾观察到在ATRA或AE诱导HL-60细胞分化过程中，CyclinE和CyclinD1蛋白表达下降，CDK2激酶活性受抑，处理4d细胞裂解物也对CDK2活性有显著抑制，且发现CDK4与CyclinD1结合能力降低［10］。上述结果表明，视黄酸及其衍生物对HL-60细胞的增殖抑制和诱导分化作用与细胞周期调控蛋白是密切相关的，RA处理的HL-60细胞CDKs活性的降低可能主要有两方面原因，其一是Cyclins调节亚基表达降低，Cyclins／CDKs复合物形成减少；其二是RA通过某种未知的途径诱导了CDKs抑制物表达，后者与相应Cyclins／CDKs结合并抑制其活性。由于CDKs活性受抑，pRb蛋白表达降低，且以低磷酸化pRb为主，致使HL-60细胞G1→S期转换受阻，并启动HL-60细胞向粒系分化的基因开放。但目前此过程中仍有许多急待阐明之处，如RA通过何种途径调节Cyclins、CDK、CKI以及pRb蛋白表达，pRb独立停滞细胞于G0／G1期及其在控制细胞分化中的作用有多大，胞内外信号如何协调Cyclins和CDKs功能来调控pRb磷酸化状态，pRb蛋白的下游作用靶或放应子是什么等都尚需进行研究。
*国家自然科学基金资助项目，No：39570296
第一作者：男，34岁，博士，副教授
参考文献
［1］ Wernberg RA．The retinoblastoma protein and cell cycle control．Cell，1995，81（3）：323
［2］ Kranenburg O，deGroot RP，Van dEbAJ．Differentiation of p19 EC cells leads to differential modulation of cyclin-dependent kinase activities and to changes in the cell cycle profile．Oncogene，1995，10（1）：87
［3］ Kizaki M，Dawson MI，Heyman R．Effects of novel retinoid X receptor selective ligands on myeloid leukemic differentiation and proliferation in vitro．Blood，1996，87（6）：1997
［4］ Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T．Molecular cloning，cold spring Harbor Lab．Press，1989
［5］ 蔡文琴，王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.78
［6］ Resnitzky D，Reed SI．Different roles for cyclinD1 and E in regulation of the G1 to S transition．Mol Cell Biol，1995，15（7）：3463
［7］ Kiyokawa H，Richon VM，Rifkind RA．Suppression of cyclin-dependent kinase 4 during induced differentiation of erythro-leukemia cells．Mol Cell Biol，1994，14：7195
［8］ Dobashi Y，Kudoh T，Matsumine A．Constitutive overexpression of CDk2 inhibits neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells．J Biol Chem，1995，270（39）：23031
［9］ Wang QM，Jones JB，Studzinski GP．Cyclin-dependent kinase inhibitor p27 as a mediator of G1-S phase block induced by 1，25-dihydroxy-vitamin D3 in HL-60 cells．Cancer Res，1996，56（2）：264
［10］ 张乾勇，糜漫天，朱俊东.视黄酸及芳维甲对HL-60细胞周期素及其相关激酶p34cdk2蛋白表达的影响.第三军医大学学报，1997，19（1）：15
（1998-02-26收稿；1998-10-07修回）