点击显示 收起
鼠抗人Fas单克隆抗体的制备及鉴定
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 技术与方法
作者：宋建勋 朱锡华 陈克敏 郑 萍
单位：宋建勋 朱锡华 陈克敏 郑 萍 第三军医大学免疫学教研室全军免疫学研究所 重庆 400038；美国哥伦比亚大学
关键词：Fas抗原 单克隆抗体 制备 鉴定
摘 要 采用Jurkat细胞免疫Balb／c小鼠制备了1株抗人Fas mAb 2A1，它能特异性识别Jurkat、Raji、THP-1细胞膜表面50KD左右的蛋白，并能与SrFas标准蛋白反应，其识别的细胞膜蛋白与单抗特异性抗人Fas PcAb N-18相一致。经Ig类与亚类及型检测试剂盒测定为IgG1、κ型，杂交瘤细胞染色体数目平均为102。
中图号 R392.11
PRODUCTION AND IDENTIFICATION OF A MONOCLONAL ANTIBODY TO HUMAN FAS ANTIGEN
Song Jianxun， Zhu Xihua， Chen Kemin， Zheng Ping
（Department of Immunology， The Third Military Medical University， Chongqing 400038）
Abstract A mAb against human Fas（huFas）， designated 2A1， was produced by fusion of the mouse myeloma cell line Sp2／0 with the spleen cells of Balb／c mice immunized with Jurkat cells． Using Dot-ELISA and western blotting and functional experiments， its was evidenced that anti-huFas mAb 2A1 is specifically directed to huFas and can recognize the Fas protein of about 50KD on Jurkat cells， Raji cells and THP-1 cells． Analysis of Ig classes subclasses and types revealed 2A1 to be IgG1， κ．
Key words Fas antigen， Monoclonal antibody（mAb）， Production， Identification
Fas／Apo-1／CD95抗原的发现起始于对两株mAb的功能观察，即抗Apo-1 mAb和抗Fas mAb［1，2］， 由于两者都能识别细胞膜上CD95蛋白抗原，且能诱导敏感细胞凋亡，才导致了今天对Fas抗原的生物医学研究。制备抗Fas mAb对于Fas抗原的深入研究，尤其是对Fas抗原信号传导机制的阐明以及生物医学应用都有重要意义。本文利用Fas＋的细胞作为免疫原，功能检测制备了1株鼠抗人Fas mAb 2A1。
1 材料和方法
1.1 培养液
1.1.1 完全培养液：含10％～20％无支原体新生小牛血清（NCS，华西医大分子生物室，批号970502），2mmol L-Gln， 20mmol Hepes， 100U／ml青霉素和100μg／ml链霉素的RPMI1640（Gbco）。
1.1.2 不完全培养液：不含NCS的完全培养液。HT培养液：完全培养液中加入1×10－4M次黄嘌呤（H）和1．6×10－5M胸腺嘧啶（T）。HAT培养液：HT培养液中加入4×10－7M氨基喋呤（A）。
1.2 细胞系 Sp2／0小鼠骨髓瘤细胞、Jurkat人T淋巴细胞性白血病细胞、Raji人Burkitt（非洲）淋巴瘤细胞、U937人组织细胞性淋巴瘤细胞为本室保存。THP-1人单核白血病细胞引自中科院上海细胞生物所。各细胞系于含10％ NCS的RPMI1640完全培养液中培养传代。
1.3 抗体 单特异性兔抗人Fas多克隆抗体（PcAb）N-18购自Santa Cruz公司。鼠抗人Fas mAb CH-11：Kamiya公司，我室访美学者郑力新赠送。HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG：购自华美公司。
1.4 动物 Balb／c雌性纯系小鼠，6～8wk，由本校实验动物中心提供。
1.5 其它主要试剂 鼠Ig类与亚类及型检测试剂盒：IsoStripTM kit购自BM公司。硝酸纤维薄膜（NC膜）：为Gibco公司产品。可溶性重组人Fas胞外区蛋白（SrFas△TM）购自PharMingen公司。融合用试剂：50％融合用聚乙二醇／PEG（Sigma， MW4 000，含10％二甲亚砜／DMSO），亮氨酸甲基酯／Leu-OMe（Sigma，MW181．7），A、H、T（Sigma），8-氮杂鸟嘌呤（Fluka），秋水仙素（Serva）。膜蛋白提取试剂：抑蛋白酶肽Aprotinin （BM），润湿剂NP-40（Fluka），苯甲基酰磺酰氟／PMSF（BM），脱氧胆酸钠（Serva），十二烷基硫酸钠／SDS和低MW蛋白标准（华美）。
1.6 抗人Fas mAb的产生 ①动物免疫：基础免疫为Balb／c小鼠腹腔注射Jurkat细胞免疫原0.2ml，含2×107细胞／鼠，免疫2次，间隔2～4wk。加强免疫为脾内加强免疫。每脾注射0．1ml细胞免疫原，含1×106细胞／脾。3d后融合。②细胞融合、筛选及克隆化：小鼠脾细胞先用2．5mmol Leu-OMe处理，再与Sp2／0按10∶1的比例以50％ PEG进行融合［3］。融合细胞用HAT培养液选择培养，杂交瘤生长后改用HT培养液，融合后10d～15d取上清进行筛选。杂交瘤上清对Jurkat细胞生长有毒性作用的孔初步定为阳性孔。克隆及亚克隆化采用有限稀释法。③腹水制备及抗体纯化：阳性杂交瘤细胞105腹腔注射石蜡油已致敏的Balb／c小鼠制备腹水，饱和（NH4）2SO4盐析和DEAE纤维素层析相结合纯化抗体。
1.7 抗人Fas mAb 2A1的鉴定 ①Dot-ELISA：SrFas抗原标准品点样于NC膜上，1％ BSA封闭后，相继用杂交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG作用，DAB显色，抗人Fas mAb CH-11作为阳性对照。②Western Blotting：Fas＋敏感细胞用PBS洗涤后，用三去污剂裂解液（50mol／L Tris-Cl， pH8．0， 150mmol／L NaCl， 0．02％ NaN3， 0．1％ SDS， 100mg／L PMSF， 1μg／ml Aprotinin， 1％ NP-40，0．5％脱氧胆酸钠）抽提膜蛋白［4］，经12％ SDS-PAGE分离，转移至NC膜后，相继用杂交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG作用，DAB显色。③杂交瘤细胞染色体分析：参照文献［5］，即秋水仙素作用获取杂交瘤细胞染色体中期分裂相，KC1低渗处理细胞，Giemsa染色。④Ig类与亚类及型鉴定：按Boehringer Mannheim公司生产的IsoStripTM试剂盒说明进行。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 用Jurkat细胞作为免疫原制备杂交瘤，分批免疫Balb／c小鼠，共72只，前后进行了8次成功融合，平均融合率约80％。从3072个杂交瘤生长孔上清中，筛选出对Jurkat细胞生长有抑制／毒性作用的孔3个，经克隆及反复亚克隆化后，分别命名为2A1，3B6，3D1。制备上清和小鼠腹水。
2.2 Dot-ELISA 经复孔试验，对杂交瘤细胞系2A1，3B6，3D1小鼠腹水测试发现：仅2A1能与SrFas蛋白反应，斑点阳性对照抗Fas mAb CH-11亦能与SrFas结合并显色，SP2／0腹水则显示阴性结果（见图1）。
图 1斑点酶联免疫吸附试验
Fig 1Dot-ELISA
1．2A1； 2．3B6； 3．3D1； 4．anti-Fas mAb CH-11；5．SP2／0
2．3 免疫印迹 Jurkat细胞、Raji细胞、THP-1细胞膜蛋白提取样品经SDS-PAGE后，用考马斯亮兰R-250染色液（0．25％考马斯亮兰R-250，25％异丙醇，10％冰乙酸）染色及脱色后，显示蛋白条带相似，与U937细胞膜蛋白条带差异明显（见图2）。经电转印及免疫染色后发现，杂交瘤腹水2A1能与Jurkat细胞、Raji细胞、THP-1细胞膜蛋白上50KD左右蛋白带反应，与特异性兔抗人Fas PcAb N-18所识别的位置一致（见图3），但在U937细胞膜蛋白带上未能检测阳性结果。
2．4 杂交瘤细胞染色体分析 染色体数目平均为102，见图4。
2．5 Ig类与亚类及型鉴定 从BM公司试剂盒检测条带上显示，杂交瘤2A1分泌的抗体为IgG1，κ型。体外传代3mo及液氮反复冻融，细胞株仍能分泌抗体。
图 2细胞膜蛋白的SDS-PAGE
Fig 2SDS-PAGE of membrane fractions
A：1．U937l；2．Jurkat；3．Molecular weight standard； 4．Raji； 5．THP-1
B：Jurkat and molecular weight standard
图 3免疫印迹
Fig 3Immunobloting analysis of Fas antigen
1．Molecular weight standard； 2．Anti-Fas PcAb N-18； 3.2A1；4．2A1 to SrFas； 5．Supernatant of SP2／0
图 4杂交瘤细胞染色体（吉氏染色，1 000×）
Fig 4The chromosomal morphology of hybridoma
cells （Giemsa’s stain， 1 000×）
3 讨论
3.1 Fas抗原的发现 Fas抗原是两个研究组于1989年同一年在各自的实验室发现的。一组是德国学者Trauth［1］所在的研究组为了抑制肿瘤的生长，采用细胞表面分子来控制其增殖；用鼠抗人B淋巴细胞系SKW6.4的单抗，来检测这些单抗对SKW6.4细胞生长的影响，在几千个抗体的实验中，发现抗Apo-1单抗能彻底抑制SKW6.4细胞的生长，并诱导植入裸鼠体内的人B细胞淋巴瘤组织消退。因为Apo-1抗原介导的信号能诱导细胞凋亡——Apoptosis，所以抗Apo-1单抗作用的细胞表面分子叫Apo-1抗原。另一组是日本学者Yonehara［2］所在研究组，发现的细胞表面分子命名为Fas，鼠抗人Fas抗体对表达有Fas抗原的人多种瘤细胞具有类似作用。1991年日本学者Itoh等［6］从T细胞淋巴瘤KT3株中克隆了Fas cDNA。1992年德国学者Oehm等［7］也从B细胞淋巴瘤SKW6.4株中纯化了Apo-1蛋白并克隆了其cDNA，证实两者序列完全一致为同一分子。1993年11月在美国Boston召开的第5届人白细胞分型国际会议上，正式命名Apo-1／Fas抗原为CD95。1994年，Suda等利用亲和层析技术从鼠细胞毒T淋巴细胞中纯化了Fas抗原的天然配体FasL［8］。
由此可知，Fas抗原分子的研究起始于抗Fas mAb的制备，正是由于制备了抗Fas mAb才有了今天对Fas抗原的较深入认识。抗Fas mAb能诱导Fas＋敏感细胞凋亡，有关Fas抗原死亡信号传导等研究离不开抗Fas mAb的作用。
3.2 抗Fas mAb制备中存在的问题 Fas抗原作为细胞膜表面受体，其抗原来源有限，这是抗Fas mAb制备过程中的一大障碍。曾有3种方案在制备抗Fas mAb时用来解决抗原量不足的问题，（1）用生物化学方法从Fas＋细胞膜上纯化Fas蛋白抗原，（2）用化学方法合成Fas抗原胞外区肽段，（3）用Fas＋细胞直接作为免疫原。开始我们曾提取Fas＋细胞膜蛋白，试图从中纯化出部分Fas蛋白抗原，但由于纯化量太低且方法不易，以及考虑到纯化的Fas抗原蛋白变性，制备出的抗Fas mAb是否能有生物学功能等原因，放弃了第1种方法；用合成肽作为抗原制备抗Fas mAb是最为简便而有效的方法，由于合成过程中刚好遇上国际上某些合成化学试剂禁运，故这条方法亦被迫停止。因此，我们制备抗Fas mAb采用的是第3种方法，即用Fas＋细胞作为免疫原，采用功能检测的方法进行筛选有生物学功能的抗Fas mAb。
Fas＋细胞采用Jurkat T淋巴细胞性白血病细胞，是因为83％的Jurkat细胞膜表面Fas抗原表达阳性，比例较高［1］。Jurkat细胞繁殖较快，传代容易，易于大量收集用于免疫的细胞免疫原。另外还证实，Jurkat细胞用有丝分裂原PHA或ConA均不能提高其细胞膜表面Fas抗原的表达量，这与国外某些实验室的实验结果一致（郑立新，美国NIH）。用Jurkat细胞作为免疫原免疫Balb／c小鼠制备mAb，细胞融合率不高，不超过75％。为提高融合率，我们曾采用对Sp2／0骨髓瘤细胞用20μg／ml的8-氮杂鸟嘌呤处理及用小鼠活体内生长的骨髓瘤细胞进行融合，但效果不理想［6］。而用Leu-OMe处理免疫脾细胞后再与Sp2／0融合，则能明显提高融合率，融合率可达90％以上，其机理不详［3］。
功能检测用来筛选阳性杂交瘤，在制备抗Fas mAb过程中虽费时、费力，但在没有足够纯化Fas抗原的情况下亦还有效。制备有生物学功能的抗Fas mAb，即是能诱导敏感细胞凋亡，换言之，能对细胞生长有抑制作用或毒性。基于这一点，我们对几千个融合阳性杂交瘤上清进行检测，寻找对敏感细胞有毒性作用的孔，最终找到3个孔的杂交瘤细胞，由此筛选到1株抗人Fas mAb。
第一作者：男，32岁，博士，讲师
全军“九五”重点课题资助项目
参考文献
1 Trauth BC，Klas C， Peters AM， et al． Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis． Science， 1989，245（4915）：301
2 Yonehara S， Ishii A，Yonehara M． A cell-killing monoclonal antibody（anti-Fas） to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor． J Exp med， 1989， 169（5）：1747
3 Seo N， Egawa K． Utilization of leucine methyl ester for the generation of hybridomas producing monoclonal antibodies specific to tumor-associated antigens， Cancer Immunol Immunother， 1994， 38（5）：277
4 Sambrook J， Fritsch EF， Maniatis T．分子克隆实验指南.第2版.金冬雁，等译.北京：科学出版社，1992.873
5 徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1992.78
6 Itoh N，Yonehara S， Ishil A， et al． The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis． Cell， 1991，66（4）：233
7 Oehm A， Behrmann I， Falk W， et al． Purification and molecular cloning of the Apo-1 cell surface antigen， a member of the tumor necrosis factor／nerve growth factor receptor superfamily． J Biol Chem， 1992，267（15）：10709
8 Suda T， Nagata S． Purfication and characterization of the Fas-ligand that induces apoptosis． J Exp Med， 1994，179（3）：873
（1998-09-23收稿；1999-01-25修回）