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丁型肝炎病人肝组织Fas／FasL和HDAg表达
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 临床免疫学
作者：顾小红 李奇芬
单位：第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆 400038
关键词：丁型肝炎病毒抗原 Fas Fas配体 免疫组化
摘 要 为研究丁型肝炎病人肝组织Fas／FasL和HDAg表达及意义，采用免疫组化单、双标记技术，检测了48例丁型肝炎病人肝组织Fas、FasL和HDAg表达，且以54例乙型肝炎作对照。结果发现，Fas以肝细胞浆表达为主，HDAg以肝细胞核和胞浆表达为主，二抗原表达及分布呈一致性。FasL以浸润淋巴细胞浆或肝细胞核表达为主，与HDAg表达及分布不全一致,3成分在各型肝炎的表达强度有显著性差别意义。提示：Fas／FasL和HDAg均与肝组织炎症活动和病理损害相关，HDV感染可诱导肝细胞表达Fas，CTL通过Fas／FasL途径介导的肝细胞凋亡与HDV致病可能有关。
中图号 R392.3
STUDY OF THE RELATIONSHIP BETWEEN THE EXPRESSION OF FAS／FASL AND HDAg IN LIVER TISSUE OF THE PATIENT WITH HEPATITIS D
Gu Xiaohong， Li Qifen
（Infectious Disease Center Southwest Hospital，The Third Military Medical University， Chongqing 400038）
Abstract To study the role and expression of Fas antigen（Fas Ag）、 Fas ligand （FasL） and hepatitis D virus antigen（ HDAg） in liver tissue of the patient with hepatitis D． Forty eight liver biopsy samples from the patients with hepatitis D were studied using immunohistochemistry to determine Fas、FasL、HDAg．Fas／HDAg、 FasL／HDAg、Fas／FasL were double stained． The results showed that FasAg was mainly expressed in the cytoplasm of hepatocytes， and HDAg in the nucleus of hepatocytes， FasL in the cytoplasm of infilirating lyinphocytes or in the nucleus of hepatocytes． These positive cells were distributed among infiltrating lymophocytes at the periportal region especially at the advanceing edges of areas of “piecemeal necrosis”． The distribution and expression of Fas and HDAg was rather closed in hepatitis D． The degree of the expression of Fas、FasL and HDAg in hepatocytes had distinct difference in different hapatitis types（P＜0．01）．These suggest that the distribution and the expression of Fas、FasL and HDAg are significantly correlated with the activity of imflammation and the severity of the liver damage， and HDV infection may induce the expression of Fas in the hepatocytes， and apoptosis caused by cytotoxic T cells（ CTL） through Fas-FasL interaction may play an important role in the hepatocytes injury by HDV infection．
Key words HDAg， Fas， Fas ligand， Immunohistochemistry
HDV感染肝炎比单独HBV感染病情及病理改变严重，其机理并不十分清楚。在病毒性肝炎的组病理研究中发现，由CTL介导的肝细胞凋亡起重要作用。在肝细胞凋亡机制中，Fas／FasL是其主要途径之一［1］。为了解细胞凋亡相关分子Fas／FasL在HDV致病机制中的作用，我们采用了免疫组化单、双标记技术，对48例丁型肝炎病人肝组织Fas／FasL和HDAg表达进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例和标本 病例均为我院住院病人，丁型肝炎48例，其中急性肝炎（AH）5例，慢性肝炎轻型（CH轻）5例，慢性肝炎中型（CH中）22例；重型肝炎（SH）16例（含慢性肝炎重型9例，亚急性重型肝炎7例）；乙型肝炎组54例，其中AH8例，CH（轻）13例，CH（中）29例，SH4例（慢性肝炎重型2例，亚急性重症肝炎2例），所有病例均经肝组织病理检查确诊。每例患者经皮肝穿获得肝组织，标本均固定于10％中性福尔马林，常规石蜡包埋，用于免疫组化单、双标记检测。
1.2 主要试剂来源 兔抗人Fas、FasL多克隆抗体和免疫组化双标记（histostain-DS）试剂盒为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术公司，丁型肝炎多克隆抗体由本科自行选定的HDV合成肽抗原经免疫家兔制备［2］，工作浓度1∶160。免疫组化染色的过氧化酶标记选用链霉卵白素（SP）试剂盒，为美国Maxin Biotech Inc产品，购自福州迈新生物技术开发公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 对照 阳性对照为预试中Fas、FasL和HDAg检测阳性丁型肝炎肝组织切片，阴性对照选自正常人肝组织，其血清各型肝炎标志物均阴性，包括肝组织Fas、FasL、HDAg、HBsAg、HBeAg、HBcAg及HCVNS3抗原免疫组化检测为阴性。此外，分别用鼠血清和PBS代替第一抗体作为替代实验，每张切片先分别检测Fas、FasL和HDAg，然后进行双标记检测。
1.4 结果判断标准 免疫组化SP法的阳性结果参照Naoki等方法观察，有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性，无色者为阴性。双标记检测中：Fas、FasL阳性细胞NBT显色为紫黑色，HDAg阳性细胞AEC显色为红棕色。免疫组化半定量判断根据Kiyoshi［3］等报道，未见阳性细胞（－），阳性细胞占肝小叶全部肝细胞的1／3以下（＋），1／3～2／3为（＋＋），2／3以上为（＋＋＋）。
2 结果
2.1 丁型肝炎Fas、FasL和HDAg表达 Fas主要表达于肝细胞浆内，部分表达在肝细胞膜上。在CH（中）和SH中，阳性细胞呈小灶状或细胞团状分布于肝小叶周边，主要在门脉周围、碎屑状坏死区尤其明显（见图1）；在CH（轻）和AH中，阳性细胞较CH（中）和SH少且分散，表达强度也较弱。
图 1慢性丁型肝炎病人肝组织Fas表达，SP200×
Fig 1Expression of Fas in liver tissue of the patient with hepatitis D， SP200×．
FasL主要表达在浸润的淋巴细胞浆或肝细胞核内，部分表达在淋巴细胞膜、肝细胞膜或浆及窦内皮细胞，阳性细胞主要在肝小叶碎屑状、桥样及灶状坏死区较为密集（见图2）。
图 2慢性丁型肝炎病人肝组织浸润淋巴细胞和肝细胞FasL表达，SP400×
Fig 2Expression of FasL in infilirating lyinphocytes and hepatocytes of the patient liver tissue with hepatitis D， SP400×．
各型肝炎比较，FasL表达强度、阳性细胞分布在CH（中）和SH中较在AH和CH（轻）强、密集。乙型肝炎中Fas、FasL表达及阳性细胞分布与丁型肝炎基本一致，两组比较见表1。
HDAg表达于肝细胞浆和／或膜和／或核内，以核型表达为主，各型肝炎中HDAg分布各有特点：CH（中）和SH中，HDAg阳性细胞呈弥散型、灶型、片簇状分布于肝小叶内，有时可见HDAg阳性细胞
表1 各型丁型肝炎Fas、FasL表达状况
Tab 1 Positive expression status of Fas and FasL in different hepatitis D groups
| n | Hepatitis D | n | Hepatitis B | |||||||||||||||||||
| Fas* | FasL** | Fas＃ | FasL＃＃ | |||||||||||||||||||
| － | ＋ | ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ | total | － | ＋ | ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ | total | － | ＋ | ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ | total | ||||||||
| AH | 5 | 2 | 2 | 1 | 0 | 3 | 2 | 2 | 1 | 0 | 3 | 8 | 4 | 2 | 2 | 0 | 4 | 3 | 4 | 1 | 0 | 5 |
| CH-Mild | 5 | 1 | 3 | 1 | 0 | 4 | 3 | 1 | 1 | 0 | 2 | 13 | 5 | 7 | 1 | 0 | 8 | 5 | 5 | 3 | 0 | 8 |
| CH-Mode | 22 | 1 | 8 | 10 | 3 | 21 | 2 | 5 | 13 | 2 | 28 | 29 | 7 | 11 | 7 | 4 | 22 | 6 | 9 | 12 | 2 | 23 |
| SH | 16 | 0 | 0 | 9 | 7 | 16 | 0 | 1 | 6 | 9 | 16 | 4 | 0 | 0 | 2 | 2 | 4 | 0 | 0 | 2 | 2 | 4 |
| Total（％） | 48 | 4（8） | 13（27） | 21（44） | 10（21） | 44（92） | 7（15） | 9（19） | 21（44） | 11（23） | 41（85） | 54 | 16（30） | 20（37） | 12（22） | 6（11） | 38（70） | 14（26） | 18（33） | 18（37） | 4（7） | 40（74） |
χ2test； **＝24．43 P＜0．01；**χ2＝29．72 P＜0．01； ＃χ2＝17．69 P＜0．05； ＃ ＃χ2＝18．4 P＜0．05
以门脉为中心沿肝索方向分布于整个肝小叶（见图3），坏死灶处及其周围较密集。在AH和CH（轻）中，HDAg阳性细胞多呈单个或小灶状稀疏分布于小叶内。各型肝炎中以CH（中）和SH的HDAG表达强度及阳性细胞比AH和CH（轻）强和密集（见表2）。
图 3慢性丁型肝炎病人肝组织HDAg表达，SP×200
Fig 3Expression of Fas in liver tissue of the patient with hepatitis D， SP200×
表2 各型丁型肝炎HDAg表达状况（％）
Tab 2 HDAg-Positive degree in different hepatitis D groups
| n | ＋ | ＋ ＋ | ＋ ＋ ＋ | |
| AH | 5 | 3 | 2 | 0 |
| CH-Mild | 5 | 4 | 1 | 0 |
| CH-Mode | 22 | 3 | 12 | 7 |
| SH | 16 | 0 | 8 | 8 |
| Total（％） | 48 | 10（21） | 23（48） | 15（31） |
χ2＝21．99 P＜0．01
2．2 丁型肝炎病人肝组织Fas／FasL和HDAg的关系 双标记检测发现Fas、FasL和HDAg结果与单标记检测基本一致。Fas、HDAg多同时表达在同一肝细胞，二者均以胞浆表达为主，单独表达的细胞也有，但数量较少。在AH和CH（轻）中，双抗原阳性细胞稀疏分布于肝小叶内，点状坏死灶处略密集。在CH（中）和SH中，双抗原阳性细胞仍在门脉周边及碎屑状坏死灶周围，以弥散、灶型或团状分布。HDAg和FasL亦可同时表达于同一肝细胞，但数目较少，较多见的是两种抗原各自表达于不同的肝细胞，可见汇管区浸润的淋巴细胞大量表达FasL，也可见肝细胞大量表达FasL，FasL、HDAg阳性细胞分布也不全一致。另外发现Fas和FasL在肝细胞内多数为同时表达，少数肝细胞可Fas强FasL弱或Fas弱FasL强表达。
总结整个实验发现：Fas、FasL和HDAg在CH（中）和SH中表达强度明显高于AH和CH（轻），经统计学处理CH（轻）与CH（中）、SH，AH与CH（中）和SH，CH（中）和SH各组间有显著差别（P＜0.01）。说明 Fas、FasL和HDAg与肝组织炎症活动及病理损害正相关。
3 讨论
Fas及FasL是介导细胞凋亡的一对膜蛋白，Fas和FasL相互作用是介导细胞凋亡的主要途径之一。实验发现：Fas／FasL常同时表达，但也见二者分布及表达的不均一性，即Fas强FasL弱或Fas弱FasL强，但二者阳性强度均随组织炎症坏死程度加重而增强，推测其意义可能为：同一肝细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发使肝细胞发生“自杀（suicide）”或分别表达Fas和FasL相邻肝细胞相互交联，导致“同胞残杀（fratricide）”［4］。另外发现不是所有病毒抗原和Fas抗原表达的区域都有淋巴细胞浸润，因此推测除了表达FasL的CTL细胞与靶细胞Fas抗原结合介导细胞凋亡外，有可能存在其它方式，如自分泌性杀伤及旁分泌死亡等途径［5］，即表达FasL的CTL等细胞分泌可溶性FasL（sFasL），通过血循环到达靶肝细胞，从而介导肝细胞凋亡。另外，由于CTL通过Fas／FasL路径引起的细胞凋亡缺乏抗原特异性，凡是Fas阳性的细胞都有可能被激活的FasL阳性CTL诱导而凋亡，与细胞是否携带病毒抗原无关，就是所谓的“旁观者溶解（Bystander LYsis）”［6］。在我们的研究中FasL表达强度与Fas、HDAg表达强度不全一致,却与肝组织炎症及病理损害一致,提示也可能存在旁观者效应。
丁型肝炎病人肝组织有Fas／FasL表达，HDAg和Fas表达强度及阳性细胞分布呈一致性，HDAg和FasL表达强度及阳性细胞分布不全一致。但通过3种成份在各型肝炎的表达强度分析发现：Fas、FasL、HDAg均与肝组织炎症活动和病理损害正相关，提示：Fas／FasL与HDV致病可能有关。丁型肝炎中除了乙肝病毒抗原可诱生肝细胞表达Fas外，HDAg也可诱生肝细胞表达Fas，正是HDV感染后HDAg诱导Fas表达的叠加作用，使感染HDV的病人大量或过度表达Fas，同时与浸润的淋巴细胞（CTL）、肝细胞的FasL及血浆中sFasL结合，一方面导致肝细胞凋亡，被病毒感染的细胞随之被清除；另一方面则导致大量肝细胞坏死，使病情和病理损害加重。在HDV致病机理中，除了由CTL通过Fas／FasL途径介导的细胞凋亡起的作用外，可能还涉及病毒颗粒的毒性作用及与HBV的相互作用，这些有待于更深入系统的研究。
第一作者：女，30岁，硕士，主治医生（现在大坪医院消化内科工作）
参考文献
1 Kaga D， Vignaux F， Ledermann B， et al． Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity． Science， 1994， 265：528
2 郑 红，李奇芬，林晓红，等.人工合成丁型肝炎病毒抗原多肽片段的特征与临床应用.中华医学杂志，1993，77：273
3 Kiyoshi Mochizuki， Norio Hayashi， Naoki Hiramatsu， et al． Fas antigen expression in liver tissues of patients with chronic hepatitis B． J of Hepatol， 1996， 24：1
4 Galle PR， Hofmann WJ， Walczak H， et al． Involvement of the CD95 （APO-／Fas） receptor and ligand in liver damage． J Eep Med， 1995， 182：1223
5 Smolarek C， Strand S， Krammer PH， et al． The Apo-1／Fas（C95） system is involved in bile-acid induced apoptosis in human hepatocytes． Hepatology， 1996， 24：956
6 Badley AD， McElhinny JA， Leibson PJ， et al． Upregulation of Fas Ligand expression by human immunodeficiency virus in human macrophages mediates apoptosis of uninfected T lymphocgtes． J Virol， 1996， 70：199
（1998-11-20收稿；1999-01-31修回）