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TGF-β1诱导HL-60细胞株凋亡作用的研究
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 基础免疫学
作者：周 芳 张书模 赖西南 王绪雷
单位：周 芳 济南军区总医院血液科 济南 250031；张书模 赖西南 第三军医大学大坪医院 重庆 400042；王绪雷 青岛医学院97级研究生
关键词：细胞凋亡 TGF-β1 HL-60 白血病细胞 基因表达
摘 要 为探讨转化生长因了β1（TGF-β1）在体外诱导早幼粒细胞白血病细胞株（HL-60）凋亡的作用及其相关的细胞和分子机制，本实验以TGF-β1在体外对HL-60细胞株作用，通过电镜、TUNEL法、流式细胞仪、免疫细胞化学等实验方法，观察TGF-β1对HL-60细胞株凋亡的诱导作用，以及相关基因的表达变化。实验发现TGF-β1可显著诱导HL-60细胞凋亡，TGF-β1下调HL-60细胞bcl-2、c-myc基因的表达可能是其诱导凋亡的分子机制之一。
中图号 Q28
STUDY ON APOPTOSIS OF HL-60 CELL LINE INDUCED BY TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β1
Zhou Fang，Zhang Shumo，Lai Xinian，Wang Xulei
（Department of Hematology，General Hospital，Jinian 250031）
Abstract To investigate the apoptosis of acute promyelocytic leukemia cell line（HL-60） induced by transforming growth factor-β1 and its possible cellular and molecular mechanisms，the acute promyelocytic leukemia cell line was exposed to different dose of transforming growth factor-β1，and the effect was studied by light microscopy，electron microscopy，flow cytometry，TDT mediated dUTP nick，labeling（TUNEL） and Immunocytochemistry（ICC），It is found that TGF-β1 could significantly induced HL-60 cell line apoptosis；The molecular mechanisms of TGF-β1 inducing HL-60 cell apoptosis maybe that TGF-β1 can effectively down-regulate the expression of bcl-2 gene and c-myc gene in HL-60 cells．
Key words Apoptosis，TGF-β1，HL-60，Leukemia cell，Gene expression
TGF-β1是造血系统重要的负调节因子，其在肿瘤的发生与发展中发挥着重要作用［1］，为进一步研究其对白血病细胞生长的抑制作用。本实验以TGF-β1在体外对人急性早幼粒白血病细胞株进行作用，以探讨TGF-β1对白血病细胞凋亡的影响。并检测凋亡前后凋亡基因的表达的变化。从而对其诱导凋亡的分子机制做了初步探讨。为TGF-β1在临床上的作用，提供科学的理论和实验依据。
1 材料和方法
1.1 细胞培养 以含10％胎牛血清RPMI1640培养液37°C、5％CO2条件下培养，倒置显微镜下计数，调整HL-60细胞浓度为5×105／ml接种于24孔培养板中，加入不同浓度TGF-β1（BOERINGER MANNHEIM），每隔24h取出1组进行动态观察。
1.2 透射电镜观察 JEM-2000EX型电子显微镜下观察照相。
1.3 TUNEL法 按凋亡试剂盒（BOEHRINGER MANNHEIM）说明进行。凋亡指数（AI）为计数每500个细胞的阳性细胞百分比。
1.4 流式细胞仪（美国BD公司FACS420型）检测DNA含量变化 按文献［2］提供方法进行。
1.5 免疫细胞化学染色方法 按文献［3］提供方法进行。
1.6 图像分析方法 采用图像分析仪EIG综合图像分析程序进行分析。1个细胞随机选择3个点，每片随机选择10个细胞取平均值。
1.7 统计学处理 所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示，以EZSTAT2软件分析，t检验确定差异性，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异非常显著。
2 结 果
2.1 细胞凋亡的形态学观察 电镜可见凋亡细胞微绒毛减少，细胞体积缩小，核染色质浓缩至核膜下，胞浆内可见大量空泡，细胞器仍完整（见图1）。
图 1电镜下TGF-β1作用HL-60细胞后凋亡细胞的形态（×5000）
Fig 1Electron micrograph of apoptotic cell of HL-60 cell line induced by TGF-β1
The nuclear chromatin condensation and aganist the nuclear membrane（×5000）
2.2 TUNEL法观察TGF-β1对HL-60细胞凋亡的诱导 TUNEL法观察凋亡细胞，光镜下阳性细胞的核呈黄色或棕色着染，细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。对AI统计分析显示，如表1。
表1 不同浓度TCF-β1作用HL-60细胞的凋亡指数AI（％）
Tab 1 AI（％） of HL-60 exposed to different dose of TGF-β1
| Dose of TGF-β1
（n／ml） |
Time（hour） | ||
| 24h | 48h | 72h | |
| 0 | 1．93±0．90 | 1．60±1．11 | 1．73±0．90 |
| 0．01 | 2．97±0．50△ | 1．80±0．53△ | 1．73±0．42△ |
| 0．1 | 14．70±2．57* | 20．73±2．10* | 22．87±2．08* |
| 1 | 23．16±2．61* | 37．33±3．14* | 49．67±5．60* |
| 10 | 23．19±2．65* | 36．40±3．70* | 49．27±4．11* |
*P＜0．01 vs control； △P＞0．05 vs control
不同浓度TGF-β1作用HL-60细胞24、48、72h后0．01ng／ml TGF-β1无明显效果（P＞0.05），而0.1ng／ml、1ng／ml及10ng／mlTGF-β1均有不同程度的诱导凋亡的作用，其中以1ng／ml作用显著，10ng／ml与其作用相似。与对照组相比相差非常显著P＜0．01。
2.3 流式细胞仪（美国BD公司FACS420型）检测DNA含量变化 结果表明，经TGF-β1 0．1ng／ml、1ng／ml及10ng／ml诱导HL-60细胞后，在DNA直方图上G0／G1期前均有一低DNA含量峰，即细胞凋亡峰，随作用时间推移逐渐高耸，表明有凋亡群体存在（见图2）。
图 2 1ng／mlTGF-β1作用HL-60细胞不同时相后流式细胞仪分析
Fig 2FACS assays the apoptotic cell of HL-60 cell line incubated with 1ng／ml TGF-β1 for different time We can see the apoptotic peak arised genevally．
2.4 TGF-β1对凋亡基因bcl-2、c-myc表达变化的影响 bcl-2、c-myc蛋白免疫细胞化学染色及图像分析对照组HL-60细胞内有bcl-2、c-myc蛋白的高表达，经1ng／mlTGF-β1作用后表达明显下调。图像分析数据显示如表2：作用24、48、72h后，与对照组相比均有不同程度的下调（P＜0．01），以72h下调最为明显。
3 讨 论
细胞的死亡是通过两条完全不同的途径：坏死
表2 TGF-β1对凋亡基因bcl-2、c-myc表达变化的影响（灰度值）
Tab 2 The effect of TGF-β1 on the exprssion of apoptotic gene bcl-2 c-myc（light degree）
| Group | bcl-2 | c-myc |
| Control | 27．80±3．17 | 20．80±4．37 |
| with TGF-β1 for24h | 30．56±2．57* | 23．42±4．45* |
| with TGF-β1 for48h | 31．37±2．76*◇ | 29．97±1．71*＋ |
| with TGF-β1 for72h | 35．01±1．34*△ | 34．61±1．61*△ |
*P＜0．01 vs control； △P＜0．01 vs with TGF-β1 for 48h group；
◇P＜0．05 vs with TGF-β1 for 24h group； ＋P＜0．01 vs with TGF-β1 for 24h group
和凋亡（apoptosis）完成的。细胞凋亡与坏死，在形态学、生化基础及发生上有着本质的不同［4］。肿瘤细胞本身可自发产生凋亡，但凋亡率很低。TGF-β1是造血系统重要的负调节因子。1994年，Muthu等［5］人以TGF-β1诱导了小鼠的粒细胞株M1凋亡，为进一步研究其对人白血病细胞生长的抑制作用，本实验以TGF-β1作用于人的急性早幼粒白血病细胞株HL-60，检测TGF-β1 对人白血病细胞凋亡的影响，并对其机制作了进一步探讨。实验证明，TGF-β1诱导的HL-60细胞的死亡属于细胞凋亡，以不同浓度的TGF-β1作用HL-60细胞株发现其作用效应是不同的，低浓度TGF-β1（0．01ng／ml）对其无明显抑制作用，1ng／ml作用显著，再加大浓度如10ng／ml时，其抑制作用效应与1ng／ml无明显差别，这可能与TGF-β1与其靶细胞相应受体结合存在饱和性有关。TGF-β1与其特殊的膜受体有较高的亲和力，且具有时间和温度依赖性及饱和性，而与其他生长因子受体无亲和力［6］。
bcl-2基因作为1种原癌基因，它与此前发现的癌基因和抑癌基因作用机理都不同，它并不是通过促进细胞生长和增殖对肿瘤的发生及发展产生影响，而是通过减少细胞凋亡而致癌的。它可阻止或降低细胞皱缩、染色质浓缩和细胞DNA降解的发生［7］。bcl-2基因可能是通过阻止受损的DNA转录出对细胞凋亡相关基因有激活作用的信号，或是可以阻止这些相关基因产物发挥其作用。所以，通过下调bcl-2基因的表达就可以促进各种因素引起的DNA损伤的细胞凋亡。
c-myc基因最初也是作为原癌基因提出的。最近的研究表明c-myc在细胞凋亡的过程中起着重要作用［8］，其具体机制尚不明确。本实验以TGF-β1诱导HL-60细胞凋亡模式检测bcl-2、c-myc表达变化，实验发现，HL-60细胞中有bcl-2及c-myc蛋白的高表达，以1ng／mlTGF-β1作用HL-60细胞24、48、72h后出现了不同程度的表达下调。24h即开始出现bcl-2、c-myc基因表达下调，48、72h下调更明显。由此可见，TGF-β1对HL-60细胞凋亡的诱导机制可能是，TGF-β1通过下调bcl-2基因的表达，使其抑制凋亡的作用减弱，从而促进了HL-60细胞的凋亡，同时TGF-β1也抑制c-myc基因的表达，使下调的c-myc蛋白对HL-60细胞的凋亡产生恒定的效应。同时，c-myc与bcl-2彼此协同促进细胞凋亡。因此，对HL-60细胞凋亡基因bcl-2、c-myc的下调可能是其诱导凋亡的机制之一。
第一作者：女，28岁，硕士，医师
参考文献
1 Liober BL，Villson JV，Hymphery LE．Autocrine transforming growth factor is associted with progression of transformed propertions in human colon cancer cells．J Cell Biol Chem，1993，268：691
2 左连富.流式细胞术样品制备技术.北京：华夏出版社，1991．14～19
3 蔡文琴，王伯云.实用免疫细胞化学与分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994
4 Wyllie AH．Glucocorticoid-induced theymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation．Nature，1980，284：555
5 Muthu selvakumaran，Toh C Red，Dan Libermann，et al．Progression of the myeloid differention program is dorminant to transforming growth factor-β1 induced apoptosis in M1 myeloid leukemia cells．Blood，1994，84（4）：1036
6 Toan Massagce，J Like B．Cellular Receptors for type-β1 transforming growth factor．J Biol Chem ，1985，260：2636
7 Hockenberg D，Nanez G，Milliman C，et al．Bcl-2 is an inner mitochordrial membrane protein that blocks programmed cell death．Nature，1990，348（22）：334
8 Kimura S，Mackawa K，Hirakawa K，et al．Alterations of c-myc expression by antisens oligodeoxynucleotides enhances the induction of apoptosis in HL-60 cells．Cancer Res，1995，55（6）：1379
（1998-09-30收稿；1999-02-03修回）