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幼鼠内毒素血症脾内单核-巨噬细胞等动态分布
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 基础免疫学
作者：孙克娅 张留保 刘 平 程向明 崔传德 胡 冰 贺之义
单位：孙克娅 崔传德 中国红十字总会南京医院儿科 南京 210001；张留保 刘 平 程向明 第二军医大学南京军医学院 南京 210099；胡 冰 贺之义 南京农业大学电镜室
关键词：单核-巨噬细胞 碱性磷酸酶 内毒素血症 一氧化氮合成酶 一氧化氮
摘 要 用组织化学和生化方法探讨了幼龄大鼠内毒素血症脾急性非特异性免疫反应。腹腔注入内毒素（i．p． LPS）1h，脾内碱性磷酸酶（ALPase）阳性细胞开始增多，至12h红髓和边缘区内呈现大量的ALP阳性细胞，24～72h这些阳性细胞逐渐减少至正常。电镜下证实这些阳性细胞多数为单核-巨噬细胞和中性粒细胞。腹注LPS 6～12h，脾索和淋巴小结周围呈现较多的一氧化氮合成酶（NOS）阳性细胞。腹注LPS 6～12h生化方法测定脾匀浆NOS和NO的水平显示两者均升高。本研究的结论是：（1）LPS可刺激脾内单核-巨噬细胞和中性粒细胞增多，表明它们有明显的动态分布；（2）脾脏NOS活性反应和NOS及NO含量有严格的时间性；（3）就幼龄大鼠来说，腹注LPS的有效毒性只能维持在24h之内。
中图号 R322
DYNAMIC DISTRIBUTION OF MONO-MACROPHAGES AND NEUTROPHILIC GRANULOCYTES IN SPLEEN OF YOUNG RAT WITH ENDOTOXAEMIA
Sun Keya， Zhang Liubao， Liu Ping， Cheng Xiangming， Cui Chuande， Hu Bing， He Zhiyi
（Department of Pediatrics， Nanjing Hospital of the Red Cross Society of China， Nanjing 210001）
Abstract Acute nonspecific immunoresponse of spleen in young rat with endotoxaemia was approached by using histochemical method and biochemical techniques． Intraperitoneal injection of LPS into the young rats resul-ted in an increase of ALP ase-positive cells in spleen at 1h after LPS injection． A number of ALPase-positive cells located in the red pulp and marginal zone at 12h． These positive cells gradually reduced to normal distribution from 24 to 72h after LPS injection． Most of these positive cells were verified as mono-macrophages and neutrophilic granulocytes by electron microscopy． There were more NOS-positive cells in spleen cord and around lymphoid follicle from 6 to 12h after LPS injection． An elevation of NOS and NO levels in spleen homogenate was tested by using biochemical techniques from 6 to 12h after LPS injection． The conclusions are as follows：（1） As mono-macrophages and neutrophilic granulocytes increase in mumber by stimulation of LPS， it is suggested that they present a pronounced dynamic distribution． （2） There is strict timeliness of NOS active reaction and NOS， NO increase in spleen． （3） Powerful toxic action only persists in 24h in young rats after LPS injection．
Key words Mono-macrophage， ALPase， Endotoxaemia， NOS， NO
大量证据表明：革兰阴性菌外膜成分中的脂多糖，通常也称内毒素（LPS），可诱导内源性一氧化氮（NO）生成，从而引起不同程度的血管扩张、血压下降、以及多器官功能障碍。单纯LPS不仅可直接诱导单核-巨噬细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和肝细胞等合成NO，而且还可触发巨噬细胞释放多种炎性细胞因子，如TNF-α、IFΝ-γ、IL-1α等，进而LPS与这些细胞因子协同诱导更多细胞合成一氧化氮合成酶（iNOS）［1～3］。由此可见，似乎iNOS的起动开关在单核-巨噬细胞系统。从微细解剖学观点看，机体除肝和脾之外，几乎其他部位从毛细血管内游出的单核细胞均受限于管壁的屏障。在正常情况下，肝和脾内的巨噬细胞明显多于其他器官。关于用LPS诱导小鼠和大鼠腹腔巨噬细胞产生NO和用LPS诱导培养的小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的报道较多［4］，而对幼鼠的研究很少，我们用组织化学方法测定幼龄大鼠内毒素血症时脾内单核-巨噬细胞、中性粒白细胞ALPase和NOS的阳性反应；用生化方法检测脾匀浆NOS和NO的含量，探讨脾在LPS刺激下，急性非特异性免疫反应的起动与终止时间，为今后研究革兰阴性菌所致幼龄大鼠肠道感染，乃至婴幼儿的肠道传染病、脾在抗感染免疫中的作用，提供部分理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物 幼龄SD大鼠（n＝70），雌雄各半，体重50～60g（30日龄），由南京医科大学、江苏省实验动物中心提供。所有动物随机分为生理盐水组（n＝10）和LPS组（n＝60）。根据时程，LPS组再分为1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h组，其中48h和72h组（n＝5），其他各组（n＝10）。按2mg LPS／kg腹腔注入，生理盐水组注入途径同LPS组。
1.2 主要试剂 马流产杆菌内毒素（上海第二军医大学微生物教研室提供）。NADPH Na4salt（95％）（BE1561 Sigma）；β-甘油磷酸钠（Emerk， Darmstadt）。氯化硝基四氮唑蓝（NBT，上海前进试剂厂）；NOS和NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
1.3 组织处理 实验动物（n＝40）在10％水合氯醛腹腔麻醉下，打开腹腔，腹主动脉放血后取脾，一部分投入80％丙酮（供ALPase反应），－20°C下固定24h，100％丙酮－20°C固定12h，换相同固定液，室温下2h，二甲苯透明1h，组织入56°C石蜡1h，然后将所有实验组的脾包埋在同一蜡块内，确保切片厚度和酶反应时间相同，取得组间比较的可信度。另一部分实验动物脾并排在冷冻头上，直接冰冻切片，4°C冰箱内保存2h（供NOS反应）。还有一部分脾切成100～200μm的小薄片在2％多聚甲醛-0．5％戊二醛混液（pH7．4，0．05mol／L二甲砷酸钠缓冲液配置）固定2h。其余实验动物（n＝30，没有48h和72h组）在10％水合氯醛麻醉下，打开腹腔，腹主动脉放血，取脾300mg匀浆（供NOS和NO含量测定）。
1.4 碱性磷酸酶组织化学和细胞化学 组织化学反应的切片和细胞化学反应的薄片，经0．1mol／L二甲砷酸钠缓冲液（pH7．4）漂洗3次，每次5min，然后入ALPase作用液孵育，37°C，1．5h，再用双蒸水漂洗3次，每次5min，组织化学反应后的切片在2％硝酸铅溶液内3min，细胞化学反应后的薄片在2％硝酸铅溶液中30min，前者经蒸馏水充分漂洗后转入0.5％硫化铵1min，经流水充分漂洗并换1次蒸馏水漂洗，自然干燥，透明封片。后者不经硫化铵反应，浸在含有8％蔗糖的0．1mol／L二甲砷酸钠缓冲液中放入4°C冰箱，次日经1％四氧化锇后固定1h，按常规电镜包埋，LKB切片机超薄切片，饱和醋酸铀单染，JEM-X-100透射电镜观察。对照片去底物反应。
1.5 NOS组织化学 冰冻切片组织在NADPH孵育液内37°C 25min。该孵育液由0．1mol／L二甲砷酸钠缓冲液10ml（含0．3％ Triton-X-100，pH7．4），10mg NADPH， 10mg NBT组成。对照片去底物反应。
1.6 NOS和NO生化测定 按南京建成生物工程研究所生产的NOS和NO试剂盒说明书测试，主要步骤：（1）称脾300mg＋2．7ml生理盐水入匀浆器，冰浴中匀浆，离心后均取50μl上清液于NOS和NO测定管内；（2）按顺序加入各试剂混匀；（3）37°C水浴孵育，根据要求确定时间；（4）在室温下静止10min，用722分光光度计比色；（5）用双缩脲法测定组织蛋白含量；（6）NOS的活性单位以每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol NO为一个活性单位（U／mg蛋白），NO则以μmol／g蛋白计算。
1.7 ALPase和NOS-阳性细胞计数 ALPase反应切片经苏木精复染，判别ALPase反应产物定位在何种细胞。在高倍镜视野下计数NOS和ALPase-阳性细胞，每组选4张反应片，每片观察5个视野。
1.8 统计学处理 对NOS和NO含量以及ALP-ase和NOS-阳性细胞进行配对t检验。
2 结果
2.1 ALPase的阳性反应 在光镜下，生理盐水组和腹腔注入LPS各组的脾脏红髓、边缘区均可见ALPase阳性反应细胞，但数量不等，白髓和边缘区可见ALPase阳性反应的毛细血管，白髓中央仅有少数ALPase阳性反应细胞。随着注入LPS时间的延长，ALPase阳性反应细胞增多，至12h达最高值（见表1），这些增多的ALPase阳性反应细胞聚集在红髓和边缘区。在边缘区这些阳性细胞似乎形成一
表1 脾碱性磷酸酶和一氧化氮合成酶阳性细胞数
Tab 1 ALPase and NOS-positive cells in number in spleen
| Groups | ALPase-positive cells
in mumber |
NOS-positive cells
in number |
|
| Saline | group | 25±8 | 12±3〓 |
| LPS | 3h | 89±17 | 17±5 |
| LPS | 6h | 128±28 | 22±4 |
| LPS | 12h | 136±32 | 26±6 |
P＜0．01，LPS 3h， 6h and 12h compared with saline group
个完整的“环”（见图1）。此时白髓内几乎没有ALP-ase阳性反应细胞。至24～72h时，脾内的阳性反应细胞呈逐渐减少趋势，腹腔注入LPS 72h组与生理盐水组ALPase阳性反应细胞的数量几乎没有区别。电镜下，ALPase的反应物主要分布在单核-巨噬细胞的溶酶体和中性粒细胞的颗粒内。
2.2 NOS的阳性反应 光镜下可见生理盐水组，内毒素1h、3h组脾白髓中央动脉有弱阳性反应以及散在的NOS弱阳性反应细胞；内毒素6h、12h组脾红髓、边缘区内NOS阳性反应细胞明显增多（见表1），类似ALPase阳性细胞“环”（见图2）。
图 1脾碱性磷酸酶阳性反应
Fig 1ALPase-positive reaction in the spleen
①a few of ALPase-positive cells locate in red pulp after saline injection×120；
②a number of ALPase-positive cells present around lymphoid follicle and in red pulp at 12h after LPS×120．
图 2一氧化氮合成酶阳性反应
Fig 2NOS-positive reaction in the spleen
①Centre arteries present slight NOS activity in the spleen after saline injection ×120；
②A lot of NOS-positive cells locate around lymphoid follicle and in red pulp at 12h after LPS ×120．
f： follicle； c： centre artery； r：red pulp
2.3 NOS和NO含量 腹腔注入内毒素后，脾匀浆中NOS和NO呈现较明显的动态变化（见表2）
3 讨论
脾是机体免疫系统的重要器官之一，在血供上它有别于其他免疫器官，几乎完全浸浴在血液中。尽管白髓仍然依赖于毛细动脉供血。众所周知，淋巴结和胸腺内巨噬细胞是血液内单核细胞穿越毛细血管壁直接进入上述器官形成的。脾索、边缘区以及白髓中央的少量巨噬细胞则是脾窦内单核细胞自由进入形成的，由此决定了脾内巨噬细胞明显多于其他免疫器官。本实验用ALPase组织化学方法也证实了
表2 腹注内毒素后脾匀浆NOS和NO的动态变化
Tab 2 Dynamic changes of NOS and NO in spleen homogenate after i．p．LPS
| Groups | NOS（U／mg Pro．） | NO（μmol／g Pro．） | |
| Saline | group | 0．5338±0．0052 | 2．5464±0．0553 |
| LPS | 1h | 0．6720±0．0068 | 2．6686±0．0310 |
| LPS | 3h | 0．6878±0．0059 | 3．0200±0．0484 |
| LPS | 6h | 0．8578±0．0083 | 3．6600±0．0455 |
| LPS | 12h | 0．7508±0．0058 | 3．5398±0．0373 |
| LPS | 24h | 0．6242±0．0072 | 3．0346±0．0374 |
P＜0．01，All LPS groups compared with saline group
脾的独特性。其他作者早年用酸性磷酸酶组织化学方法也给予了证实［5］。实验结果表明，在腹腔注入LPS后，随时程延长脾内ALPase阳性细胞逐渐增多，各内毒素组均多于生理盐水组，这就提示脾索和边缘区属于动态分布区域［5］。实验显示，机体受内毒素刺激后能迅速使脾内ALPase阳性细胞增多，我们认为：（1）在外界物质刺激下，循环血中单核细胞和中性粒细胞再分配，积极行使非特异性免疫；（2）在微解剖结构上脾索与脾窦之间存在“自由区”；（3）据信，脾索和边缘区既存在固有的具有活跃吞噬能力的巨噬细胞，也存在静止状态的巨噬细胞，一旦机体受到外界刺激后能快速恢复到功能状态。腹腔注入内毒素后，我们发现NOS和NO含量随时程延长逐渐增加，至6～12h达高峰，然后开始减少。而丁传林等对培养的小鼠腹腔巨噬细胞经LPS诱生，产生NO的高峰在24～48h，累积峰值在96h［4］，这表明内、外环境不同，影响LPS的因素甚多，LPS的有效维持时间不尽一致。本实验观察到，人工腹腔注入LPS6～12h，不论NOS阳性细胞，还是NOS和NO的含量均较其他时相多，表明LPS诱导有NOS合成能力的细胞，并非瞬间效应［6］，需要一定的时间来完成识别、结合、触发和合成。章国良等推测这段时间正好等于从mRNA表达的启动至酶蛋白合成所需的时间，故对iNOS可在酶活性及基因表达两个水平进行调控［7］。在脾淋巴小结周围形成的ALPase阳性细胞和NOS阳性细胞“环”，几乎都是在内毒素注入6h后，表明两种酶的活性反应可出现在具有多种功能的同一类细胞，也可出现在具有相同功能的不同细胞。新近研究证明：人类脾有别于大鼠和小鼠，在边缘区周围存在滤泡周围区，该区是淋巴细胞再循环和抗原进入的区域［5］。在大鼠，脾边缘区可能是抗原进入的部位，与本实验ALPase阳性细胞与NOS阳性细胞“环”相吻合，显示出非特异性免疫的防御作用。在非特异性免疫中多形核白细胞对巨噬细胞有协同作用［8］。在免疫过程的非特异性阶段，巨噬细胞担负着处理、浓缩抗原等关键作用。由ALPase阳性细胞和NOS阳性细胞“环”，我们推测，初级淋巴小结是个“净化区”，未经巨噬细胞处理的抗原不允许与幼稚的B淋巴细胞接触，这大概是有些淋巴小结有生发中心，有的没有生发中心的缘故。实验显示：给幼龄大鼠腹注LPS6～12h时，脾匀浆NOS和NO含量达最高值，脾内NOS阳性细胞呈最强染色。Meltzer等从尾静脉给成年大鼠注LPS 6h后，iNOS阳性细胞呈最强染色［9］，表明幼龄大鼠和成年大鼠脾脏均能敏感地接受LPS的刺激。最近我们探讨了幼龄大鼠淋巴结和胸腺组织对LPS的刺激反应，尽管腹注LPS长达24h，也未观察到NOS有明显的阳性反应。我们认为，幼龄大鼠出现内毒素血症时，脾脏最先积极参与了急性非特异性免疫反应，且在抗感染免疫中起重要作用。
第一作者：女，40岁，本科，主治医生
南京市科委资助课题（97532）
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（1998-10-19收稿；1999-02-12修回）