硫代反义寡核苷酸体外对HDV的抑制作用

硫代反义寡核苷酸体外对HDV的抑制作用

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 中国免疫学会首届青年学术会议优秀论文选登

作者：蒋业贵　李奇芬　毛 青　王宇明　王升启

单位：蒋业贵　李奇芬　毛 青　王宇明（第三军医大学西南医院全军传染病中心，重庆 400038）；王升启（军事医学科学院放射医学研完所，北京 100850）

关键词：硫代反义寡核苷酸；丁型肝炎病毒；HDV/HBV感染；人胎肝细胞

　　摘　要：目的观察硫代反义寡核苷酸(S-ASODN)体外对HDV的抑制作用：方法在HDV/HBV感染人胎肝细胞中加入不同浓度的针对HDV Stem Ⅰ区684～698位核苷酸的15聚S-ASODN，分别采用ELISA和班点杂交法检测上清液中HDAg和细胞中HDV rNA。结果 HBsAg、HDAg在感染后第2d至第16d均可测出，以第4d至第12d达高峰。加入S-ASODN(2、4、6μmol／L)后2d,肝细胞中HDV复制受到抑制，培养上清中HDAg分泌量也减少,其抑制率呈剂量依赖关系；在同等剂量时(4μmol／L),S-ASODN作用2d、4d、6d，对HDV抑制率大至相同。结论 hDV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达1Zd；S-ASODN能有效抑制HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDV复制与表达。本研究为进—步在动物体内研究S-A-SODN抗HDV作用和向临床过渡提供了有益的实验依据。

　　分类号：R392　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8861(2000)02-0125-04

Inhibitory effect of HDV by antisense phosphorothioate oligodeoxynu-cleotide in vitro

JIANG Yie-gui Null ,MAO qing(Centre of Infectious Diseases,Southwest Hospital,the Third Military Medical university,Chongqing.400038)

　　wANG Sheng-qi(Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences.Beijing100850，China)

　　wANG Yu-ming(Centre of Infectious Diseases,Southwest Hospital,the Third Military Medical university,Chongqing.400038)

　　Abstract：Objective to study inhibitory effect of replication and expression of HDV by antisense phosphorotioate oligodeoxynucleotide(S-ASODN)．Methods a15-mer antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide(S-ASODN)was complementary to stem-Ⅰregion(nuclectide 684～698％)was added to edium of HDV/HBV-infected human fetal hepatocytes.HDAg and HDV RNA were detected by ELISA,is situ hybridization and dot blot hybridization.Results HDAg，HBsAg could be de-tected from day 2 to day 16 after HDV/HBV-infection.Secretion of hDAg reached summit from day 4 to day 12 intertion．Dav2 after S-ASODN(2、4、6μmol/L)was added into the medium of hepatoeytes,HDV RNA was inhibited，Secretion of HDAg in the supernant was reduced．Inhibitory rate showed the feature of dosage dependence．Conclusion primary human fe-tal hepatocyte is competent for infection with HDV/HBV，HDV can stably replicate and express in human tetal hepatocytes，and at least this replication and expression can reach for 12 days．S-ASODN can availably inhibit replication and expression of HDV in HDV/HBV-infected human fetal hepatocytes．This study may he valuble for further research in animal and in clinic use．

　　Keywords：Antisense phosphorotaioate oligodeoxynucleotied；Hepatitis d virus；HDV/HBV co-infection;Human fetal hepatocyte

　　HDV采取“双滚环方式”进行复制[1]，核酶在HDV的复制过程中起着重要作用。已经证实以HDV基因链核酶为靶序列，针对不同功能区的A-SODN在分子水平能不同程度地抑制核酶的自裂,其中互补于核酶的自裂点和StemⅠ区者，几手可完全抑制核酶的自裂[2]。本研究在其基础上观察其硫代修饰物(S-ASODN)在HDV/HBV感染人胎肝细胞中对HDV复制与表达的抑制作用。

　　 1材料与方法 1.1人胎肝细胞人工流产22周龄胎儿肝脏，经体外两步灌流法分离肝细胞，台盼蓝染色细胞成活率达90%以上用于实验。

　　 1.2HDV／HBV感染血清HBV感染血清取自本科慢性乙型肝炎患者，EUSA检测HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗-Hec(+)，血清斑点杂交HBVDAN(+),甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒标志均为阴性。HDV感染血清取自本科丁型肝炎患者，ELISA检测、HDAg(+)、抗-HD(+)，血清斑点杂交HDVRNA(+)。

　　 1．3硫代反义寡核苷酸互补于HDV基同链核酶自裂位点和stemⅠ区684～696位核苷酸的15聚ASODN(5’-CATGCCGGCCATCAG-3’)的合成在DNA合成仪上自动完成，硫代修饰ASODN采用TETD/乙氰法，高效薄层色谱法纯化。同时合成15聚核苷酸同源链(5’-CTGATGTCCGGCATG-3’)及M13(5‘-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)测序引物，作正义核苷酸及非互补随机核苷酸对照。

　　 1.4实验方法 1．4.1实验分组：实验分为4组：S-ASODN治疗组(group1)、正义核苷酸对照组(group2)、随机序列对照组(group3)和空白对照组(group4)，每组24孔。

　　 1.4.2实验步骤：将分离的人胎肝细胞用含10%小牛血清(FBS)的1640培养液调整细胞浓度为4×105/ml，接种于24孔塑料培养板内，每孔含培养液0．5ml(即每孔含细胞数为2×105个)，每24h更换培养液。培养48h后，于培养液中同时加入HEV、HDV感染血清(终浓度均为10%)，并在培养液中加入4％聚乙二醇(PEG)。37℃培养16h(过夜)后，弃去上清液,细胞用1640培养液洗涤3次后(最后1次洗涤液留样待检),加入含10%FBS和2%二甲基亚枫(DM50)的新鲜1640培养液(不含PEG)，每48h更换培养液(培养液组成同前)。每48h收集上清液和肝细胞。利用上述建立的HDV／HBV感染人胎肝细胞培养系统，在加入感染血清16h，并经3次洗涤后加入不同浓度核苷酸。S-ASODN组设2、4、6μmol/L3个终浓度,其它各组终浓度均为4μmol／L。在加入核苷酸后2、4、6d分别收集上清液和细胞。

　　 1.5检测指标及方法培养上清液中HBsAg、HDAg检测，采用ELISA法，细胞中HBsAg、HDAg检测,采用免疫组化SP法，细胞中HBVDNA、HDVRNA检测，采用原位杂交法和斑点杂交法，细胞总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法快速抽提。培养上清液中HBVDNAHDVRNA检测，采用斑点杂交法。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照和替代对照。

　　 1.6结果分析及统计学处理 1.6.1上清液中HBsAg、HDAg检测结果在酶联免疫检测仪上于450nm处测各孔光密度(OD值)。HDAg抑制率公式为： 1.6．2细胞中的HBsAg、HDAg检测：阳性呈黄褐色，阴性不显色。

　　 1.6．3原位杂交检测HBVDNA和HDVRNA：阳性呈紫蓝色,阴性不显色。

　　 1．6.4细胞中HDVCdna斑点杂交：阳性呈紫蓝色,阴性不显色。阳性结果进行薄层色谱扫描，得出阳性面积比，细胞中HDVRNA抑制率公式为： 全部数据经数理统计PDA-2进行方差分析，全部数据以x-±s，表示。

　　 2结果 2．1HDV、HBV在人胎肝细胞中稳定复制表达留存洗涤液中HBsAg、HDAg均早阴性，感染后所有留存系列上清液中HBsAg、HDAg均呈阳性，HBsAg、HDAg在感染后第2d至第16d均可测出,以第4d至第12d达高峰(见图1)。免疫组化检测细胞中HBsAg、HDAg均呈阳性表达(见图2、图3)，空白对照组均呈阴性表达。原位杂交HBVDNA、HDVRNA均呈阳性表达。上清中HBVDNA和HDVRNA斑点杂交也均呈阳性表达。

　　 图1上清中HBsAg和HDAg含量的动态曲线 Fig1DynamiccurveofHBsAgandHDAginsupernant 2．2S-ASODN抑制作用的序列特异性各组药物按4μmol／L加入培养细胞，48h后检测上清中HDAg。S-ASODN对HDAgG的抑制率为62．01%，正义核苷酸、随机序列核苷酸对HDAg无抑制作用(见表1)。提示S-ASODN抑制作用是其特异性封闭靶序列的结果。　图2HDVHBV感染人胎肝细胞中HBsAg表达(S-P400)

　　 Fig2ExpressionofHBsAginhumanfetalhepatocyteswithHADHBVinfection(S-P400)

　　 图3HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDAg表达(S-P400)

　　 Fig3ExpressionofHDAginhumanfetalhepatocyteswithHDV/HBVinfection(S-P400)

　　 表1各组药物对HDAg的影响 Tab1EffectofHDASbymedicineineachgroup *P＜0．01ascomparedwithcontrolgroup 2．3S-ASOND抑制作用的持续时间于给药后2d、4d、6d分别检测S-ASODN(4μmol/L)组8个标本上清中HDAg和细胞中HDVRNA(见表2)。3个时相抑制率相近，提示S-ASOND1次给药后抑制效应可持续6d以上。

　　 表2S-ASODN不同作用时间对HDAg和HDVRNA的抑制作用 Tab2InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNindifferenttime 2．4S-ASODN对HDV的抑制作用呈剂量依赖性加入不同浓度的S-ASODN于HDV/HBV感染人胎肝细胞培养系统中，随着5-ASODN浓度的增加,人胎肝细胞表达HDAg和HDVRNA逐渐减弱(见表3、4、5)。提示：S-ASODN对HDVRNA和HDAg抑制作用呈剂量依赖性。

　　 表3S-ASODN作用2d对HDAg和HDVRNA的抑制作用 Tab3InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNafter2days *P＜0．01ascomparedwithcontrolgroup 表4S-ASODN作用4d对HDAg和HDVRNA的抑制作用 Tab4InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNafter4days *P＜0.01ascomparedwithcontrolgroup表5S-ASODN作用6d对HDAg和HADRNA的抑制作用 Tab5InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNafter6days *P＜0.01ascomparedwithcontrolgroup 3讨论 目前，有关S-ASOND抗HDV作用的研究,主要是利用HDV基因转染细胞株，但这些细胞株不能完全模拟人体内肝细胞的生物学功能，用于研究S-ASOND抗HDV作用时，不能完全代表体内的情况。用人胎肝细胞作为感染对象，建立HDV/HBV感染人胎肝细胞培养系统，可很好解决上述不足，有学者设计了一种激素限量培养液(hormonede-finedmedium，HDM)模拟肝细胞生长的环境，能够使原代培养的肝细胞维持良好的分化和增殖功能达50d以上[3，4]，本研究采用该方法成功地培养人胎肝细胞达20d以上。鉴于长期体外培养人胎肝细胞有一定难度，故采用HBV、HDV同时感染方式感染人胎肝细胞，并在培养液中加入PEG以利HBV、UDV进入肝细胞。HDV的包装需HBsAg，故在培养液中加入DMSO以促进HBsAg的表达[5]。本研究发现，感染后第2d至第16d培养上清中可检出HBsAg，第4d至第12d达高峰，与国外有关文献报道一致，HDAg分泌与HBsAz相—致，以后HBsAg和HDAg分泌逐渐下降。分析其可能原因：培养早期细胞增殖较快，因细胞有接触抑制特性，细胞增殖到一定程度，增殖速度变慢，最后完全停止增殖，维持—定时间后，细胞开始死亡、脱落。本研究认为UBV、HDV在人胎肝细胞中能稳定复制表达，其根据：①留存冼涤液标本中HBsAg和HDAg均呈阴性,斑点杂交示HBVDNA和HDVRNA也呈阴性，基本排除感染血清残留对实验造成的干扰，②组胞中HBsAg、HDAg、HBVDNA和HDVRNA均呈阳性,说明HBV和HDV已进入肝细胞;③由于每隔48h更换培养液，系列培养上清中HBsAg、HDAg、HBVDNA和HDVRNA均呈阳性,且维持较前相同或稍高水平，有一分泌高峰,说明HBV和HDV及其表达的抗原持续分泌至培养液中。

　　 现在一致认为，HDVRNA采用“双滚环机制”进行复制,在复制过程中需要HDVRNA的自裂，而自裂又取决于核酶活性，因此核酶在HDVRNA复制中起着重要作用；若抑制核酶活性，HDV的复制也将受到抑制。研究表明,针对自裂位点和stemⅠ区的ASODN抑制HDVRNA基因链核酶自裂作用最强。本研究在此基础上针对自裂位点和stemⅠ区684～698位核苷酸合成了15聚ASODN，并进行硫代修饰，在感染HDV/HBV人胎肝细胞中观察其抗HDV作用，实验结果表明，S-ASODN可抑制HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDV基闲复制与表达,抑制效果在浓度2-6μmol/L时呈剂量依赖关系，终浓度为6μmol／L时抑制率最高。相同剂量的S-ASODN作用2、4、6d,其抑制率大致相同,提示：一次应用S-ASODN其抑制HDV作用可持续6d以上。正义链、随机链两条寡核苷酸无抗HDV作用,提示本研究所合成的针对HDV基因链核酶自裂位点和Stem1区的S-ASODN可特异地与靶基因结合，有效地抑制HDV基因复制与表达。本实验说明S-ASODN对HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDV复制与表达具有抑制作用，为进一步在动物体内研究S-ASODN抗HDV作用和向临床过渡提供了有益的实验依据。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570166)

　　作者简介：蒋业贵(1966-)男，安徽巢湖市人，住院医师,博士生,主要从事病毒性肝炎的研究。

　　参考文献：

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　　［2］毛青，王升启，李奇芬，等．反义寡核苷酸抑制丁型肝炎病毒基因链核酶活性作用[J].中华医学杂志．1996．76：30～33

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收稿日期：1999-09-10

修稿日期：1999-11-30