M—CSF对RAW264．7细胞氧化损伤的保护作用

M—CSF对RAW264．7细胞氧化损伤的保护作用

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 基础免疫学

作者：庞战军　周 玫　陈 瑗

单位：第一军医大学生物化学与分子生物学研究所自由基医学研究室，广东 广州 510515

关键词：巨噬细胞集落刺激因子；氧化应激；动脉粥样硬化；RAW264．7细胞系

　　摘　要：目的揭示巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是否能保护单核巨噬细胞免受过氧化损伤。方法 以L929细胞条件培养液(L929—CM)作为M-CSP来源，以细胞显微形态、细胞活力等指标，观察了M—CSF对叔丁基氢过氧化物(tbOOH)诱导的巨噬细胞系RAW264．7细胞氧化损伤的影响。结果tbOOH可以引起RAW284．7细胞的损伤，表现为细胞皱缩、伪足消失、细胞活力降低，且损伤随tbOOH作用浓度的增加而明显；而M—CSF可以减轻tbOOH诱发的RAW264．7细胞氧化损伤。结论 m—CSF对单核巨噬细胞的氧化损伤具有保护作用。

　　分类号：R345．49　文献标识码：A

　　文章编号：1000—8861(2000)—D2—0102-04

Macrophage colony—stimulating factor protects RAW264．7 cells from Oxidative injury

pANG Zhan—jun ,ZHOU Mei,CHEN Yuan(Research Laboratory of Free Radical Medicine,the First Military Medicakl University, Guangzhou 510515，China)

　　Abstract：Objective To find out if macrophage colony—stimulating factor(M-CSF)can protect monocvte/macrophage from oxidative injury.Methods We investigated the effect of m—CSF on RAW264．7 cells incubated with tert-butyl hydropero-xide(tbOOH)applying L929 conditioned Medium(L929—CM)as the source of m—CSF，and using the changes of cell morphol-ogy and survival rate as the indices．Results Found that tbOOH could bring oxidative damage to RAW264．7 cells，and the in-jury got severer with the concentration of tbOOH increased；M—CSF could alleviate the tbOOH induced oxidative injury to RAW264．7 cells．Conculsion m—CSF could protect monocytes/macrophages/macrophages from oxidative injury.

　　Keywords：macrophage colony stimulating factor；oxidative stress；atherosclerosis；RAW264．7 cell line 巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony—stimulatingfactor，M-CSF)是一种单核巨噬细胞特异性的生长因子，在小鼠L929细胞系中呈高表达,L929细胞条件培养液(L929cell—conditionedmedium．L929—CM)可用来进行有关M-CSF的研究[1]。M—CSF对于巨噬细胞的单核细胞前体的增殖、分化及成熟细胞的存活与活化都起着重要的作用[2]。为探讨M-CSF能否保护单核／巨噬细胞免受过氧化损伤,我们以tbOOH对RAW264．7细胞的损伤作为模型，用L929-CM作为M-CSF来源，探讨了M-CSF对tbOOH引起的单核／巨噬细胞氧化损伤的影响。

　　 1材料与方法 1.1材料RPMI-1640、tbOOH(tert-butylhy-droperoxide)、MTT[3-(4，5-dimethylthlazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]、还原型谷胱甘肽(GSH)购自美国Sigma公司；小牛血清购自杭州四季青公司；其它试剂均为分析纯。

　　 1．2L929—CM的收集与活性鉴定L92细胞培养在含10%小牛血清的RPML-1640培养基中(5％CO2，95%湿润空气，37℃，以下细胞培养条件同)，待细胞生长至融合单层后，换不含血清的RPMI-1640培养基继续培养5～7d，将培养液3000g×10min离心后吸取上清，并过滤除菌,即为L929-CM。集落刺激因子活性鉴定采用集落形成计数法[3]；取小鼠股骨骨髓细胞在含30%小牛血清、0．45mmol／L还原型谷胱甘肽、0．3%琼脂、20％L929-CM、髓细胞浓度为105/ml的培养体系中培养7d(以下含血清的RPMI-1640培养基替换L929-CM作为对照)，按超过50个细胞的细胞团为一个集落(CFU-GM)计数，测得收集到的L929-CM的平均活性约为500CFU-GM/ml。

　　 1．3细胞活力测定采用MTT法[4]。按20μl／孔向接种有细胞的96孔板中加入MTT(5mg/ml，溶于生理盐水)，继续培养4h后，弃去上清，每孔中加入100μl二甲亚砜(DMSO)溶解生成的formazane紫色结晶。比色测定在∑960型酶标测定仪上进行，设定波长为570nm。

　　 1.4统计学处理数据表示为均值±标准差，统计学分析均采用两样本均数比较的t检验。

　　 2结果 2．1M—CSF处理的RAW264．7细胞的形态变化取指数生长期的RAW264．7细胞，接种于含1%小牛血清的培养基，向培养基中加入25%(V/V)的L929—CM(M—CSF)，对照组以不含血清的RPMI—1640培养基代替L929—CM，分别作用12h，观察细胞的显微形态。结果发现，经过M—CSF处理的RAW264．7细胞变得较大，并伸出许多伪足(见图1)。

　　 2．2M-CSF对tbOOH诱发的RAW2,64．7细胞氧 图1M—CSF处理的RAW264．7细胞形态变化 Fig1MorphologyofRAW264．7cellstreatedwith/withoutM-CSFfor12hours A:non-treated；B：M-CSFtreated 化损伤保护作用的形态学观察M-CSF处理组的RAW264．7细胞培养基中加入259%(V／V)的L929—CM(M-CSF)，对照组以不含血清的RFMI-1640培养基代替，正常培养条件下(5％CO2，95%湿润空气，37℃)预处理24h。然后分别受0．5×10-4mol／L、1×10-4mol／LtbOOH作用6h，显微镜下观察细胞形态。结果发现M-CSF处理组的细胞大多数形态完整、透亮，伪足较多，提示功能活跃；而对照组细胞则大多数变圆、缩小，细胞结构不清，提示功能衰退(见图2)。

　　 2．3M—CSF对tbOOH引发的RAW264．7细胞氧化损伤保护作用的细胞活力分析M-CSF处理组的RAW264．7细胞培养基中加入25%(V／V)的L929-CM(M-CSF)，对照组以不含血清的RPMI-1640培养基代替，预孵24h。然后分别加入终浓度为0、0．25、0．5、1、2、4×10-4mol／L的tbOOH并继续作用6h，用MTT法分析各组细胞的活力。结果发现，在tbOOH损伤6h后，与对照组相比较，经M-CSF预处理的各种细胞保持较高活力(见图3)。

　　 3讨论 近年来对动脉粥样硬化疾病发生机理较为公认的假说是：动脉粥样硬化是一种由内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞等多种细胞参与的炎症反应，氧化修饰低密度脂蛋白(Ox-LDL)在其发生发展过程中起了重要作用。Ox-LDL与正常人血清低密度脂蛋白(n-LDL)的主要区别在于其中的氧化成分，如氧化的胆固醇组分等。单核细胞来源的巨噬细胞受Ox-LDL作用发生细胞泡沫样变、形成动脉粥样硬化病变的主要组成部分——泡沫细胞、甚至最终死亡崩解，其最主要的原因是由于Ox—LDL中的氧化成分对巨噬细胞的氧化损伤。提高单核／巨噬细胞抗氧化图2叔丁基氢过氧化物作用下M-CSF处理及无处理RAW264．7细胞的形态变化 Fig2Cellmorphology：effectofM-CSFonRAW264．7cellsincubatedwithtbOOH A：control—tbOOH(0．5×10-4mol/L)；B:M—CSFtreated+tbOOH(0．5×10-4mol/L);C：control+tbOOH(1×10-4mol/L)；D：M-CSFtreated+tbOOH(1×10-4mol/L)

　　 图3M—CSF对受不同浓度叔丁基氢过氧化物作用的RAW264．7细胞存活率的影响 Fig3EffectofM-CSFonsurvivalratesofRAW264．7cellsincubatedwithdifferentconcentrati

　　onsoftbOOH Datawerepresentedasmean±s，n=10*P<0.05，**P<0.01ascomparedwiththecontrolgroup 损伤能力的措施必然对于动脉粥样硬化疾病的防治有着重要的意义。

　　 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞等分泌的一种巨噬细胞特异性的生长因子，L929细胞中的M-CSF基因已被克隆出来[5]。M-CSF是一种糖蛋白，以自分泌或旁分泌的形式释放，被邻近或自身的M-CSF受体识别和结合，激活受体激酶而发挥作用。M-CSF能激活成熟巨噬细胞的一系列功能，在动脉粥样硬化疾病发生发展过程中起着重要作用。INOUE等[5]发现体内注射外源性M-CSF能够抑制Watanabe遗传性高脂血症家兔泡沫细胞形成、阻止动脉粥样硬化的发展和缩小动脉粥样硬化斑块的面积。鉴于氧化损伤在动脉硬化疾病病理发生过程中所起的重要作用，我们推测M—CSF对动脉硬化的预防作用可能与其抗细胞氧化损伤的作用有关。

　　 由于M-CSF对单核细胞的化学趋化特性，很多研究认为M-CSF在动脉粥样硬化发生的起始阶段起着促进作用[7]。但也有研究认为，M-CSF不能单纯地被认为促进动脉粥样硬化的形成。尽管单核细胞的募集常常被理解为促使动脉粥样硬化斑块的形成，但这也可以是一种机体限制脂质积累的防御反应。单核细胞来源的巨噬细胞通过负反馈限制胆固醇吞噬的能力会随其泡沫样变而降低，提高泡沫细胞活力的治疗措施必定可以增强泡沫细胞的功能并促进病变的恢复。M—CSF对单核/巨噬细胞的功能起着重要的的调节作用,然而在动脉粥样硬化病变的泡沫细胞中M-CSF则表达极少，这可能与泡沫细胞的活力受损直接相关[8]。给子外源性的M-CSF可以提高泡沫细胞中M-CSF的表达,并同时对实验性动脉粥样硬化具有预防及治疗作用。我们的研究发现了一些M-CSF能够防止单核/巨噬细胞氧化损伤的证据，L929—CM和重组人M-CSF(rhM-CSF)均能防止氧化剂对小鼠腹腔巨噬细胞的损伤，L929—CM的作用可以部分被抗M-CSF的单抗所阻断，同时也说明L929-CM中保护单核/巨噬细胞免受氧化损伤的有效成分主要是M-CSF[9,10]。本实验又表明，L929-CM可以减轻tbOOH对RAW264．7细胞引起的氧化损伤,进一步证实了我们有关M-CSF能够保护单核／巨噬细胞免受过氧化损伤的推测。

　　 经M-CSF处理的RAW264．7细胞形态发生了一些变化，表现为伪足增多、细胞体积略增大，这与其他学者的报道相类似,推测这些形态上的变化可能与细胞功能密切相关，即M-CSF处理的单核巨噬细胞功能活动增强。而M-CSF对单核巨噬细胞氧化损伤的保护作用则可能与M-CSF增强的单核巨噬细胞功能活动直接有关：可能受M-CSF处理后，单核巨噬细胞内氧化胆固醇的外排能力增加，促使细胞远离氧化胆固醇等氧化物，从而减轻氧化损伤。其具体作用机理尚需进—步揭示。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970867，39570197)

　　作者简介：庞战军(1973-),男，河南偃师人，助教，博士生，主要从事有关自由基与免疫调节的研究。参考文献：

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收稿日期：1999-07-14

修稿日期：1999-11-16