点击显示 收起
从噬菌体随机十五肽库中筛选类脂A模拟肽的研究
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 基础免疫学
作者：文维延 刘北一 富宁
单位：文维延（第一军医大学免疫学教研室，广东 广州 510515）；刘北一（第一军医大学免疫学教研室，广东 广州 510515）；富宁（第一军医大学免疫学教研室，广东 广州 510515）
关键词：噬菌体肽库；类脂A；模拟肽
李文桂 石佑恩
［摘 要］ 目的 研究血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清NO浓度的影响。方法 第1次实验用106和108CFU疫苗分别皮下注射免疫BALB／C鼠，免疫后8周用日本血吸虫尾蚴攻击，感染后6周剖杀小鼠，同时设有PBS对照组；第2次实验用106CFU疫苗皮下和静脉分别注射免疫鼠，于免疫后0、4、8、10、14和16周各剖杀4只，分离血清，用NO试剂盒检测小鼠血清NO浓度。结果 发现疫苗免疫，尾蚴攻击后血清NO浓度降低；疫苗皮下和静脉注射免疫后4～16周血清NO浓度升高，分别于免疫后10周或16周达最高水平。结论 血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗能降低感染鼠血清NO浓度，提高宿主抗血吸虫感染的保护力。
［关键词］ 血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗；NO
［中图分类号］ R383.2＋4；R392.11 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0272-03
Effects of recombinant BCG-Sj26GST vaccine of schistosome on NO concentration of serum in mice
LI Wen-gui1，SHI You-en2
（1.Institute of Infectious and Parasitic Diseases，the First Affiliated Hospital，Chongqing Medical Univer-sity，Chongqing 400016，China； 2.Department of Parasitology，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China）
［Abstract］ Objective To study effects of recombinant BCG-Sj26GST vaccine of schistosome on NO concentration of serum in mice．Methods In the first experiment，BALB／C mice were immunized subcutaneously by 106 and 108 CFU vaccine respectively，challenged with Sj cercariae on 8 weeks of immunization and killed on 6 weeks of infection to separate sera，PBS served as control；In the second experiment，after immunized subcutaneously and intravenously by 106 CFU vaccine respectively，4 mice were killed to separate sera on 0，4，8，10，14 and 16 weeks of immunization．NO concentration of serum were detected by NO kit．Results It has been found that NO concentration decreased by immunization with rBCG-Sj26GST vaccine against challenge with Sj cercariae；dynamic observation showed NO concentration increased on 4～16 weeks，reached the highest level on 10 weeks and 16 weeks respectively in the subcutaneous and intravenous group．Conclusion rBCG-Sj26GST vaccine of schistosome may decrease NO concentration in sera of infected mice，and increase host’s protection against schistosomiasis．
［Key words］ recombinant BCG-Sj26GST vaccine of schistosome；NO
NO是一种免疫效应分子，在巨噬细胞杀伤血吸虫童虫过程中起重要作用，它引起靶细胞酶的铁丢失，从而杀伤童虫［1］。NO抑制脾淋巴细胞增殖，抑制Th1分泌IL-2和IFN-γ，但促进Th2分泌IL-4［2～4］。NO也可促进细胞凋亡，进一步研究表明它能硝基化半胱氨酸残基的活性部位，从而使组织转谷氨酰胺酶和Caspase介导的聚腺苷酸聚合酶失活引起细胞凋亡［5，6］。作者等［7］用血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗皮下注射接种BALB／C鼠，初步实验结果表明该疫苗可产生较好的保护力，在此基础上，本文研究该疫苗对小鼠血清NO浓度的影响，从而为阐明其作用机制提供有意义的材料。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：为雌性12～14周龄的BALB／C鼠，购自同济医科大学附属同济医院动物中心，2次实验共购78只小鼠。
1.1.2 血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗：由同济医科大学分子生物学教研室提供。
1.1.3 试剂：NO试剂盒购自北京邦定生物医学公司，批号1998-514。
1.2 方法
1.2.1 实验分组、疫苗注射部位、途径、剂量及次数：第1次实验分3组，每组10只小鼠，第1和2组分别为106和108CFU疫苗皮下注射组，第3组为PBS对照。第2次实验分2组，每组24只小鼠，分别为106CFU疫苗皮下和静脉注射组。106或108疫苗悬浮于100 μl PBS用于接种。
1.2.2 攻击感染：第1次实验进行攻击感染，疫苗免疫8周后用日本血吸虫大陆株正常尾蚴经腹部皮肤感染各组少鼠，每只感染40±2条尾蚴。
1.2.3 血清收集：第1次实验尾蚴攻击感染后6周剖杀小鼠，第2次实验在疫苗免疫前，疫苗免疫后4、8、10、14和16周各剖杀4只小鼠，眼球取血，室温下静置12 h，2 000 r／min 10 min，分离血清，－20 °C冰箱冻存待查。
1.2.4 小鼠血清NO浓度检测：按试剂盒说明书进行操作。
2 结果
2.1 第1次实验 血清NO浓度检测结果见表1，106CFU疫苗免疫，尾蚴攻击后，NO浓度显著降低，与对照组相比，差异有极显著意义；108CFU疫苗免疫，尾蚴攻击后，NO浓度降低，与对照组相比，差异有显著意义；106与108CFU疫苗组相比，NO浓度差别也有极显著意义（t＝3.17，P＜0.01）。
表1 rBCG-Sj26GST疫苗免疫，尾蚴攻击后小鼠血清NO浓度
Tab 1 NO concentration in sera of mice after immunization with rBCG-Sj26GST vaccine against challenge with Sj cercaria
| group | No of
mice |
No of Sj
cercariae |
average NO concen-
tration in sera（μmol／L） |
t | P |
| 106 CFU | 9 | 40±2 | 0.34±0.22 | 4.05 | ＜0.01 |
| 108 CFU | 8 | 40±2 | 0.64±0.16 | 2.20 | ＜0.05 |
| PBS control | 9 | 40±2 | 1.00±0.24 | — | — |
| 2.2 第2次实验 血清NO浓度动态观察见表2及图1。疫苗皮下或静脉注射后，血清NO浓度在免疫后4～16周升高，皮下注射组在免疫后10周达高峰，而静脉注射组在免疫后16周达高峰，统计学分析发现免疫后4、8、10、14和16周与0周相比，差别有显著或极显著意义。同一时间点相比，皮下和静脉注射组NO浓度差别无显著意义（P＞0.05）。
表2 血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫不同时间后小鼠血清NO平均浓度 Tab 2 Average NO concentration in sera of mice in different time by immunization with rBCG-Sj26SGT vaccine |
| time of
detection（w） |
No of
mice |
average NO concentration in sera | |
| subcutaneous | intravenous | ||
| 0 | 4 | 0.21±0.23 | 0.21±0.23 |
| 4 | 4 | 0.53±0.31 | 0.65±0.21 |
| 8 | 4 | 0.56±0.08 | 0.60±0.16 |
| 10 | 4 | 0.87±0.09 | 0.76±0.08 |
| 14 | 4 | 0.56±0.18 | 0.89±0.21 |
| 16 | 4 | 0.71±0.13 | 0.93±0.14 |
| P＜0.05； P＜0.01，compared with 0 week． |
| 图1血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清NO动态观察
Fig 1Dynamic observation of NO concentration in sera of mice immunized by rBCG-Sj26GST vaccine of schistosome． 3 讨论 KULLBERG等［8］发现感染Sm的BALB／C鼠脾细胞中Th1分泌IL-2和IFN-γ降低，而Th2分泌IL-4、IL-5和IL-10增加，KEISARI等［9］用Sm冻融童虫疫苗免疫鼠，尾蚴攻击后发现鼠脾细胞分泌IL-1、IL-2和TNF-α增加，WYNN等［10］用Sm减毒活疫苗接种C57BL／6鼠，尾蚴攻击后发现肺部炎症区有高水平IL-2、IFN-γ和TNF-α mRNA表达。本文显示疫苗免疫组血清NO浓度显著降低，据报道NO能抑制脾淋巴细胞增殖，抑制Th1分泌IL-2和IFN-γ［2，3］，我们结合本文推测血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗可能降低鼠血清中NO浓度，则解除了对脾淋巴细胞增殖的抑制，因而T淋巴细胞增生，分泌大量细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α，从而提高宿主抗血吸虫感染的保护性免疫力，这与Sm减毒活疫苗或冻融童虫疫苗的免疫效果相一致。 刘莉等［11，12］发现C57BL／6鼠感染日本血吸虫后，IL-2在感染后6周上升，8周达高峰，10周下降，14周恢复正常水平，IFN-γ在感染后4周开始上升，6～7周达高峰，8周开始下降，12周恢复正常水平；TNF-α在感染后6周开始上升，7～8周达高峰，10周开始下降。GREEN等［13］发现IFN-γ和TNF-α单克隆抗体抑制NO合成，间接证明IFN-γ和TNF-α促进NO合成。本文显示疫苗皮下注射免疫后10周血清NO浓度达最高水平，而静脉注射免疫后16周才达最高水平，此时脾淋巴细胞增殖受到抑制，因而T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α降低，基本上符合刘莉报道的结果。 ［作者简介］ 李文桂（1967－），男，湖北郧县人，主治医师，医学博士，主要从事分子免疫学的研究。 李文桂（重庆医科大学附一院传染病寄生虫病研究所，重庆 400016） 石佑恩（同济医科大学寄生虫学教研室，湖北 武汉 430030） ［参考文献］ ［1］ JAMES SL，GLAVEN J．Macrophage cytotoxicity against schistosomula of schistosoma mansoni involves arginine-dependent production of reactive nitrogen intermediates［J］．J Immunol，1989，143（12）：4 208－4 212． ［2］ HOFFMAN RA，LANGREHR JM，BILLIAR TR，et al．Alloantigen-induced activation of rat splenocytes is regulated by the oxidative metabolism of L-arginine［J］．J Immunol，1990，145（7）：2 220－2 226． ［3］ TAYLOR-ROBINSON AW，LIEW FY，SEVERN A，et al．Regulation of the immune response by nitric oxide differentially produced by T helper type 1 and T helper type 2 cells［J］．Eur J Immunol，1994，24（5）：980－984． ［4］ CHANG RH，FENG MHL，LIU WH，et al．Nitric oxide increased interleukin-4 expression in T lymphocytes［J］．Immunol，1997，90（1）：364－369． ［5］ ALBINA JE，CUI SH，MATEO RB，et al．Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages［J］．J Immunol，1993，150（11）：5 080－5 085． ［6］ MELINO G，BERNASSOLA F，KNIGHT RA，et al．S-nitrosylation regulates apoptosis［J］．Nature，1997，388（2）：432－433． ［7］ 李文桂，石佑恩，汪燕鸣，等．血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗接种后保护力的观察［J］．同济医科大学学报，1999，28（1）：13－16． ［8］ KULLBERG MC．Infection with schistosoma mansoni alters Th1／Th2 cytokine responses to a non-parasite antigen［J］．J Immunol，1992，148（10）：3 264－3 270. ［9］ KEISARI Y，SEGER M，LENGY J，et al．IL-1，TNF-α and IL-2 production by peritoneal and spleen cells from schistosoma mansoni infected mice and its potentiation by preimmunization with schistosomal antigens and immunostimulants［J］．Immunobiol，1993，188（1）：446－459． ［10］ WYNN TA，OSWALD IP，ELTOUM IA，et al．Elevated expression of Th1 cytokines and nitric oxide synthase in the lungs of vaccinated mice after challenge infection with Schistosoma mansoni［J］．J Immunol，1994，153（11）：5 200－5 209． ［11］ 刘 莉，沈一平，管晓虹，等．日本血吸虫感染小鼠脾细胞IL-2及IFN-γ动态观察［J］．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1995，13（1）：35－38． ［12］ 刘 莉，沈一平，管晓虹，等．日本血吸虫感染小鼠TNF诱导水平的动态研究［J］．中国血吸虫病防治杂志，1995，7（2）：80－81． ［13］ GREEN SJ，NACY CA，SCHREIBER RD，et al．Neutralization of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha blocks in vivo synthesis of nitrogen oxides from L-arginine and protection against francisella tularensis infection in mycobacterium bovis BCG-treated mice［J］．Infect Immunol，1993，61（2）：689－698． ［收稿日期］ 1999-10-06； ［修回日期］ 2000-01-02 |