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人FasL分子的克隆、表达及多抗制备
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 技术与方法
作者：王华 高杰英 刘永全 彭虹 罗振革
单位：王华（军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850）；高杰英（军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850）；刘永全（军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850）；彭虹（军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850）；罗振革（军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室，北京 100850）
关键词：FasL；融合蛋白；大肠杆菌表达；多克隆抗体
［摘 要］ 目的 获得人FasL蛋白，并对其功能进行初步研究。方法 用DNA重组法构建了FasL cDNA和谷胱甘肽转硫酶融合原核表达质粒pGEX-KG-hFL。将重组质粒转入大肠杆菌JM109，经0.2 mmol／L IPTG在37 °C条件下诱导3 h，SDS-PAGE检测。用8 mol／L尿素溶解的包涵体作为免疫原免疫家兔制备多抗。结果 融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20％。多抗效价达1∶102 400，此多抗可以与重组蛋白发生很好的抗原抗体反应。结论 hFL在大肠杆菌中得到高效表达，为深入研究FasL提供了材料。
［中图分类号］ R392.11 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0304-05
Cloning and expression and polyclonal antibody preparation of human FasL
WANG Hua， GAO Jie-ying， LIU Yong-quan， PENG Hong， LUO Zhen-ge
（Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Science， Beijing 100850， China）
［Abstract］ Objective The study is aimed at obtaining FasL protein and doing some research about its function． Me-thods We constructed E．coli expressed vector pGEX-KG-hFL， and FasL cDNA fused to the 3’end of the gene encoding the GST protein． The fusion protein was expressed in E．coli JM109 at 37 °C after 0.2 mmol／L IPTG induction for 3 hours． Inclusion bodies dissolved in the solution of 8 mol／L urea were used as immunogen to prepare the polyclonal antibody． Results The fusion protein of high expression has a molecular weight of 46 kd by SDS-PAGE． The yield of the FasL fused protein was 20 percent in total proteins． We observed that the polyclonal antibody can recognize fusion protein and GST by immunoblotting． Conclusion The successful expression of FasL fusion protein and preparation of polyclonal antibody will provide material for further studies of FasL．
［Key words］ FasL； fusion protein； E．coli expression； polyclonal antibody
FasL （fas ligand）分子属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）超家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白。其相应的受体为Fas（CD95），FasL可以传达死亡信号给Fas从而诱导细胞凋亡。FasL分子在一系列生理和病理反应中发挥重要作用。如参与T、B淋巴细胞的克隆选择；介导细胞毒T细胞（CTL）对靶细胞的杀伤作用；参与免疫耐受的形成等。FasL作为Fas系统的一个重要成员日益受到人们的重视。目前国外对于人和鼠的FasL分子的研究已较为深入，主要集中在FasL与疾病的关系及其在疾病治疗中所起的作用。而国内的研究则多局限在检测疾病过程中FasL分子的异常表达方面，而且至今尚无其表达成功的报道。本研究从人FasL分子入手，获得了该分子的胞外区cDNA，利用原核融合蛋白表达系统得到重组hFasL胞外区蛋白的表达，对重组产物进行了初步纯化和鉴定，制备了相应的多克隆抗体，为我们今后进行Fas／FasL系统的研究做了必要的准备。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细菌菌株和质粒载体：E．coli JM109等菌株及pUC-18和pGEX-KG等质粒由本室保存，pBX-hFL质粒由日本东京大学郭卯戊博士惠赠。
1．1．2 酶及其它试剂：Taq DNA聚合酶，限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ，T4 DNA连接酶等购自原平生物工程公司及华美生物工程公司；生物素标记羊抗兔IgG，亲和素标记HRP，生物素标记蛋白质标准分子量等均由本室制备。
1．1．3 实验动物：日本大耳白家兔，2～2．5 kg，雄性。由本院动物中心提供。
1．2 方法
1．2.1 PCR引物设计：按照引物设计原则，根据人Fas Ligand cDNA序列［1］并按构建融合蛋白pGEX-KG表达载体的要求，设计一对引物（由上海生物工程公司合成）用于扩增人FasL胞外区，利用PCRDESN软件分析两条引物间的配对情况，基本符合PCR引物的要求。上游引物primer1：5’-GCGAATTCAGCTCTTCCACCTACAGAAG-3’下游引物primer2：5’-GCGTCGACTTAGAGCTTATATAAGCCG-3’。primer1引入EcoRⅠ酶切点，primer2引入SalⅠ酶切点，此对引物应能扩增出编码人FasL分子胞外区的DNA片段。
1．2.2 目的片段的扩增：以pBX-hFL质粒为模板进行PCR扩增，反应条件是94 °C 1 min，46 °C 1 min，72 °C 1．5 min，进行5个循环；94 °C 1 min，72 °C 2 min共进行25个循环，最后在72 °C延伸10 min。取5 μl反应液在1％琼脂糖凝胶电泳上进行扩增产物检测分析。
1．2．3 DNA片段的回收和纯化：将扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳后切下含目的片段的胶块，－20 °C置30 min， 12 000 g 4 °C离心5 min，取上清，加入1／10体积3 N的NaAC及2倍体积的无水乙醇，0 °C下放置20 min后，12 000 g 4 °C离心5 min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，弃上清，真空抽干。沉淀溶于TE中，进行定量分析，－20 °C储存备用。
1．2．4 pUC-18-hFL重组质粒的构建：PCR扩增目的片段和pUC-18载体用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶进行连接。采用碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，以pUC-18空载体的迁移距离为标准，筛选滞后的重组子。并以EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切进行鉴定。
1．2.5 DNA序列测定：由大连宝生物公司自动测序仪（ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer）测定。
1．2．6 表达载体的构建与鉴定：以EcoRⅠ／SalⅠ双酶切从重组克隆载体pUC-18-hFL分离目的片段，回收纯化后与经相同酶切的pGEX-KG载体相连，得到重组表达载体pGEX-KG-hFL。采用碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，以pGEX-KG空载体的迁移距离为标准，筛选滞后的重组子。再以EcoRⅠ／SalⅠ双酶切作进一步鉴定。
1．2.7 pGEX-KG-hFL融合蛋白的诱导表达：挑取新鲜的含重组质粒pGEX-KG-hFL的大肠杆菌JM109单菌落及含空载体质粒的对照JM109单菌落置4 ml LB培养液中（含Amp100 μg／ml），37 °C振摇过夜，次日将饱和菌液以1∶200的稀释度加入4 ml LB培养液中37 °C振摇3 h后加入IPTG至终浓度0.2 mmol，37 °C继续振摇3 h进行诱导后，12 000 g离心5 min，取沉淀悬于100 μl TE溶液中备用［2］。
1．2.8 重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳：将菌体沉淀各取20 μ1，加入等体积的2×样品处理液，100 °C加热5 min，进行SDS-PAGE电泳，样品胶为4％，分离胶12.6％，稳定电压140 V直至溴酚蓝染料跑至胶底，取出凝胶用考马斯亮兰染色15 min，然后脱色至背景清晰。
1．2.9 表达蛋白的纯化：200 ml菌体培养液离心收集菌体，用PBS（pH7.0）洗涤2次，30 ml Tris缓冲液（1 mmol／L MEDTA，pH7．0）悬浮菌体，超声破碎后于4 °C 12 000 g离心10 min，收集沉淀，进行包涵体的初步纯化：将沉淀用5 ml含1％ Triton-100的2 mol／L和4 mol／L尿素各洗涤1次，最后用含1 mol／L DTT的8 mol／L尿素悬浮沉淀，37 °C温浴10 min，于室温12 000 g离心20 min后收集上清，即为初步纯化的重组蛋白。纯化过程中每一步收集的上清各取20 μ1加等体积的2×样品处理液，沸水浴5 min，进行SDS-PAGE电泳。
1．2.10 多克隆抗体的制备：按常规方法进行。8 mol／L尿素溶解的包涵体进行SDS-PAGE电泳后根据蛋白Marker切下目的融合蛋白冷冻干燥，研磨成粉末，免疫前以无菌PBS溶解，和等体积弗氏完全佐剂充分混合，皮下多点注射家兔，每只家兔融合蛋白的用量为180 μg；每间隔2周加强免疫1次，共加强4次，每次免疫的剂量同上，从第3次免疫后1周开始测定血清抗体效价，末次免疫后2周心脏采血。分离血清，取部分进行纯化，制备IgG，分装置－20 °C保存。
1．2.11 Western Blot检测hFasL融合蛋白免疫学活性：将重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，然后进行蛋白质电转移，将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上（滤膜孔径0.3 μm，转移条件为400 mA转印40 min）。用制备的兔抗人FasL多抗与膜上的蛋白进行抗原-抗体反应，用生物素-亲和素标记系统进行检测，DAB（0.6 mg／ml）显色，至目的条带染色清晰时终止反应。
2 结果
2.1 PCR扩增hFasL DNA片段 用设计的两条引物从pBX-hFL质粒上扩增出了540 bp大小的DNA片段，与预期分子量大小相符（见图1）。
2.2 重组质粒的构建及鉴定 采用pUC-18克隆载体系统（见图2）。将以EcoRⅠ／SalⅠ双酶切的540 bp产物与pUC-18载体相连，转化大肠杆菌JM109，进行重组克隆的筛选，碱裂解法小量制备阳性克隆株质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用蓝斑质粒作为对照，可见重组质粒明显大于对照组质粒。用SalⅠ单酶切，重组质粒酶切产物在3．2 kb处出现条带。用EcoRⅠ／SalⅠ双酶切鉴定，重组质粒酶切产物分别在540 bp和2．7 kb处出现条带（见图3）。
图1PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 1Agarose gel electrophoresis of the PCR product
lane 1：ΦX174DNA／HaeⅢ marker
lane 2：PCR production of hFasL
图2重组质粒pUC-18-hFL，pGEX-KG-hFL构建图
Fig 2Construction of hFasL cDNA fragment into vector pUC-18 and pGEX-KG
2.3 DNA测序 将pUC-18-hFL重组质粒送至大连宝生物工程公司，所测序列与文献报道基本相同，只是在第301倍及364位发生了由A-G的突变，从而造成了第101和第122个氨基酸的改变，用Goldkey软件分析抗原表位表明突变后的蛋白可能会在第100位左右增加一个较强的表位，而原来的抗原表位不受影响。
2．4 表达载体的构建 碱裂解法小量制备pUC-18-hFL重组质粒，用EcoRⅠ／SalⅠ双酶切后回收540 bp的目的片段，与经过同样双酶切的原核融合蛋白表达载体pGEX-KG相连，得到重组质粒pGEX-KG-hFL，转化大肠杆菌JM109，和碱裂解法小量制备可疑克隆株质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用空pGEX-KG载体作为对照，可见重组质粒明显大于对照组质粒。用SalI单酶切，重组质粒酶切产物在5．5 kb处出现条带。用EcoRⅠ／SalⅠ双酶切鉴定，重组质粒酶切产物分别在540 bp和5 kb处出现条带。通过上述检测得到阳性克隆（见图2，图4）。
图3重组质粒pUC-18-hFL的酶切鉴定
Fig 3Electrophoresis for pUC-18-hFL on 1％ agarose gel
lane 1：ΦX174DNA／HaeⅢ marker； lane 2：vector plasmid pUC-18； lane 3：pUC-18-hFL plasmid； lane 4：pUC-18-hFL plasmid digested with SalⅠ； lane 5： pUC-18-hFL plasmid digested with EcoRⅠ and SalⅠ
图4重组质粒pGEX-KG-hFL的酶切鉴定
Fig 4Identification of the recombinant plasmid
lane 1：ΦX174DNA／HaeⅢ marker； lane 2：vector plasmid pGEX-KG； lane 3：recombinant plasmid pGEX-KG-hFL； lane 4：recombinant plasmid digested with SalⅠ； lane 5：recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and SalⅠ
2.5 重组蛋白的表达与鉴定 将含载体质粒pGEX-KG和重组质粒pGEX-KG-hFL的菌株用0.2 mmol／L IPTG进行诱导，诱导3 h后，收集菌体进行超声破碎，离心后分别收集沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳检测，看到含空载体质粒pGEX-KG的菌在26 kd处有高表达蛋白，其分子量与载体蛋白GST完全一致,说明诱导表达的是载体蛋白；而含重组质粒pGEX-KG-hFL的菌经IPTG诱导后，在分子量约46 kd处出现一条新的蛋白带，其大小与推测的hFL融合蛋白分子量相一致,表达量约占菌体总蛋白的20％。hFL融合蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中，上清液中诱导表达的融合蛋白含量很低（见图5）。
图5重组蛋白SDS-PAGE电泳
Fig 5SDS-PAGE analysis of the recombinant protein
lane 1：molecular weight marker； lane 2：E．coli JM109； lane 3：pGEX-KG-hFL／JM109； lane 4：supernatant of pGEX-KG-hFL／JM109； lane 5：supernatant of 2 mol／L urea soluble products； lane 6：supernatant of 4 mol／L urea soluble products； lane 7：supernatant of 8 mol／L urea soluble products； lane 8：pGEX-KG／JM109
2．6 重组蛋白的初步纯化 重组的hFasL胞外区表达产物是一种融合蛋白，在菌体中可以可溶性和包涵体形式存在。菌体经IPTG诱导，超声破碎后离心，收集菌体沉淀进行包涵体的初步纯化：使用1％ Triton X-100， 2 mol／L，4 mol／L尿素对包涵体逐级洗涤，再用8 mol／L尿素溶解。对以上的洗涤及溶解上清用SDS-PAGE电泳分析，结果显示1％ Triton X-100，2 mol／L尿素可洗脱掉部分杂蛋白，4 mol／L尿素可溶解部分包涵体，而大部分包涵体溶于8 mol／L尿素中（见图5）。
2.7 hFasL融合蛋白的Western Blot鉴定 以包涵体作为免疫原制备了兔抗hFasL多抗，用饱和硫酸盐沉淀法［3］进行纯化，制备IgG，经酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶102 400。用兔抗hFasL多抗对融合蛋白进行免疫印迹实验，证实在46 kd处有一特异性条带。说明表达的hFasL蛋白具有较好的免疫学活性（见图6）。
3 讨论
3.1 关于测序结果中的两处点突变 用PCR法扩增得到hFasL胞外区cDNA，测序时发现核苷酸序列中有两处发生点突变，其可能原因较为复杂：本实验中使用Taq DNA聚合酶，其错误碱基掺入率为2×10－4，PCR引起的突变为56％（在给定错误率下将200 bp的靶序列扩增106倍时，PCR引起的噪音百分比），同时聚合酶的忠实性依反应条件和靶序列的不同而有很大变化。总之，突变的产生主要是由于PCR的忠实性有限所致。应用Goldkey软件分析，这两处突变不会影响hFasL蛋白的抗原性，但还需实验证实。
图6hFasL重组蛋白的Western-Blot鉴定
Fig 6Immunoblotting analysis of hFL recombinant protein
lane 1：biotin-labeled protein molecular weight marker；lane 2：pGEX-KG-hFL／JM109； lane 3：supernatant of 8 mol／L urea soluble products； lane 4：pGEX-KG／JM109
3.2 表达载体的选择 我们采用pGEX-KG载体进行FasL cDNA的表达，它是属于pGEX系统的融合蛋白高效表达载体，该载体SD顺序下游是谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，该基因与克隆的外源基因相连。诱导表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体。该载体的优点是将外源蛋白基因置于载体蛋白GST基因后边，可以减少真核基因中大肠杆菌稀有密码子对蛋白表达的影响；可诱导目的蛋白高效表达，本实验中我们应用此表达载体成功地获得了hFasL胞外区的重组蛋白，其表达量占菌体总蛋白的20％［4，5］。
3.3 多克隆抗体的特异性 我们将8 mol／L尿素溶解的融合蛋白包涵体经SDS-PAGE电泳分离，按照分子量marker将46 kda处的目的蛋白胶块切下，因仅为电泳纯，可能仍然含有微量的杂蛋白，故免疫动物后会产生针对杂蛋白的抗体。从Western blot中可以观察到hFasL的多抗不仅可以针对融合蛋白和载体蛋白，而且可以和其它一些蛋白条带起反应，但同时我们也注意到多抗几乎不与比目的蛋白分子量大的蛋白起反应，同时在与重组质粒菌体蛋白相对应的载体质粒菌体蛋白并没有与多抗发生抗原抗体反应，因此可以认为与多抗反应的可能是断裂的重组融合蛋白（超声破碎过程中断裂或是被大肠杆菌内部存在的蛋白酶降解产生）。
本文获得了hFasL分子的胞外区cDNA，在原核细胞中成功表达，并制备了相应的多克隆抗体，为进一步研究hFasL分子的生物学功能及其在粘膜免疫中的作用奠定了良好的基础。
［作者简介］ 王华（1972－），女，山西太原市人，在读博士研究生，主要从事粘膜免疫的研究。
［参考文献］
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［收稿日期］ 1999-09-01；［修回日期］ 2000-03-16