Fas/FasL在大鼠急性胰腺炎肺组织中的表达

　【摘要】 目的 探讨Fas/FasL在大鼠急性胰腺炎肺组织中的表达。方法 大鼠胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠，制作大鼠重症急性胰腺炎并发肺损伤模型。将实验大鼠分为正常对照组、胰腺炎1、4、8、12、24h组。分别对胰腺损伤、肺损伤程度进行病理评分，测定血清脂肪酶水平，并测定肺组织湿/干重比;免疫组化方法检测大鼠肺组织内Fas/FasL蛋白的表达水平。结果 造模后1h，大鼠即出现较明显的胰腺损伤，伴有血清脂肪酶升高，随着时间的延长，胰腺损伤逐渐加重，以12h为重。造模后1h，即出现肺组织损伤，此后，肺损伤程度逐渐增加，以24h为重;光镜下主要表现为肺组织炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔内渗出液、肺泡腔塌陷等。造模1h后，大鼠肺组织内Fas、FasL表达增加，至24h达最高水平。结论 Fas/FasL可能参与了胰腺炎肺损伤的病理过程，Fas/FasL系统及其介导的细胞凋亡在胰腺炎肺损伤中的确切作用有待于进一步研究。
     
　　关键词 急性胰腺炎 动物模型 急性肺损伤 Fas/FasL
      
　　Intrapulmonary expression of Fas/FasL in rats with acute pancreatitis  

　　Lin Dongdong，Sun Jiabang，Li Fei，et al.

    Department of Hepatobiliary，Youan Hospital，Capital University  of Medical Sciences，Beijing100054.
     
　　【Abstract】 Objective To explore the expression of Fas/FasL in lung tissue of rats with acute pancreatitis.Methods Pancreatitis was induced with3.5%sodium taurocholate by method of Aho et al.Animals were sacrificed at1，4，8，12，and24hours after induction of pancreatitis.The severity of pancreatitis was evaluated by quantitating serum lipase and pancreatic pathologic score.Lung injury was evaluated by lung pathologic score and lung water conˉtent.The expression of Fas/FasL in lung tissue was determined and localized by immunohistochemistry.Results Pancreatic injury and lung injury can be found at1hour after induction of pancreatitis with3.5%sodium tauroˉcholate.Pancreatic injurywas most severe at12hours，while lung injurywas most severe at24hours.The microscopˉic findings of lung injury included leukocytes infiltration in lung tissue，pulmonary sepatal thickening，pneunoedema and collapse of alveolar cavity.Immunohistochemistry stain show Fas/FasL expression in lung tissue were abscent in normal lung tissue，Fas/FasL expression in lung tissue gradually increased1hour after inducton of pancreatitis，then reached their peaks at24hours.Conclusion Fas/FasL were involved in the pathogenesis of pancreatitis associated lung injury（PALl）.The exact roles of Fas/FasL and Fas/FasL mediated apoptosis in PALl were not clear at present，so more studies on them should be performed.
     
　　Key words acute pancreatitis animal model acute lung injury Fas/FasL  

　　Fas/FasL系统在正常生理状态下参与了淋巴细胞的发育、分化和免疫调节;在病理状态下，通过介导细胞凋亡，在自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤发生等病理过程中起重要调控作用 ［1］  。本研究通过大鼠急性胰腺炎模型，探讨Fas/FasL在急性胰腺炎肺损伤中的作用。

　　1 材料和方法

  　  1.1 动物及分组 雄性Wistar大鼠43只（购自首都医科大学实验动物中心），体重250～300g;随机分为正常对照组（6只）、胰腺炎不同时点组（胰腺炎1、4、8、12、24h组分别为7、7、7、7、9只）。

    　1.2 胰腺炎模型的制备 大鼠实验前14h开始禁食，自由饮水。参照Aho ［2］  等的方法制备急性坏死性胰腺炎模型。

　　1.3 取材方法 实验结束后，将大鼠剖腹，肉眼观察胰腺炎症轻重情况。下腔静脉穿刺取血，静置2h后，以3800r/min离心3min，取血清-20℃冻存，用于测血清脂肪酶，取胰头固定位置胰腺组织，10%甲醛固定，制成石蜡切片，用于HE染色。开胸，取左肺下叶，10%甲醛固定，制成石蜡切片，用于HE染色;取右肺上叶，称湿重后，锡箔纸包裹，-20℃冻存，用于计算肺组织的湿/干重比。

    　1.4 血清脂肪酶测定 以全自动生化分析仪采用酶显色法测定大鼠血清脂肪酶。

    　1.5 病理学检查 采用盲法，由病理科医生在光镜下观察胰腺及肺组织学改变。（1）胰腺损伤组织学评分:以改良Schmidt ［3］  法，并参照Pozsar ［4］  的方法对胰腺损伤进行评分。（2）肺损伤组织学评分:参照Hofbauer ［5］  等的方法，根据肺实质组织和空肺泡所占面积的百分比判断肺损伤的程度。

　　1.6 肺组织湿/干重比 肺组织湿/干重比 ［6］  :将已称重的大鼠肺组织放入烤箱内，160℃烘烤48h，再称重，计算肺组织的湿/干重比。

   　 1.7 肺组织Fas、FasL免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡至水，0.5M TBS漂洗3次，每次2min;3%H 2 O 2 室温孵育20min，消除内源性过氧化物酶的活性;TBS漂洗3次，每次2min;将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）的容器中，置微波炉内加热，微波火力P-20，时间为12min，室温下冷却20min;加入兔抗Fas（FasL）抗体（1:400），阴性对照不加一抗，以正常血清代替，4℃孵育过夜;TBS漂洗3次，每次2min;滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，室温孵育1h;TBS漂洗3次，每次2min;DAB显色;蒸馏水冲洗、苏木素复染、脱水、封片。

　　2 结果

    2.1 胰腺炎大鼠胰腺及肺组织病理变化

    2.1.1 胰腺病理变化 光镜下观察:造模后1h即可见胰腺小叶间隙增宽及少量炎细胞浸润;此后，随着时间的延长，胰腺损伤逐渐加重，12h胰腺损伤已经十分显著，表现 为胰腺组织水肿、出血及片状坏死，大量炎细胞浸润、部分腺叶正常结构消失。造模24h组死亡2只，死亡率为22.22%。胰腺损伤病理评分显示:造模后1、4、8、12、24h胰腺损伤病理评分与正常对照组比较差异有显著性;造模后1、4、8、12h，胰腺损伤病理评分逐渐升高，而且各组之间差异有显著性（表1）。

    2.1.2 肺组织病理改变 正常对照组大鼠肺组织肉眼及光镜下均未见明显病变。造模1h后，大鼠肺组织可见轻度损伤，主要表现为肺泡间隔增宽、炎细胞浸润;造模8h后，大鼠肺组织损伤明显加重，部分大鼠出现胸水，光镜下可见肺泡间隔更宽，炎性细胞浸润增加，肺泡腔内出现渗出液，部分肺泡腔塌陷。12h及24h大鼠肺组织损伤更加严重，可见出血、实变。

    肺损伤病理评分显示:造模后1、4、8、12、24h肺损伤与正常对照组比较差异有显著性（P<0.05）;随着时间的延长，肺损伤病理评分逐渐升高，但是其升高幅度小于胰腺损伤病理评分升高幅度。

    表1 大鼠胰腺及肺组织损伤、肺组织湿/干重比、血清脂肪酶比较 （略）

　　2.2 胰腺炎大鼠血清脂肪酶的变化 造模1h后，即可见胰腺炎大鼠血清脂肪酶较正常对照组明显升高;此后，随着时间的延长，胰腺炎大鼠血清脂肪酶逐渐升高，至12h达到最高值;但是，4、8、12h组比较，大鼠血清脂肪酶差异无显著性;24h组大鼠血清脂肪酶水平较12h时略有下降，但是两者之间差异无显著性（表1）。

    2.3 胰腺炎大鼠肺组织湿/干重比变化 造模后，随着时间的延长，大鼠肺组织湿/干重比逐渐升高;造模4h后各组与正常对照组比较，差异有显著性;造模8h后各组与1h组比较差异有显著性;造模24h大鼠肺组织湿/干重比达到最高值;造模8、12、24h各组肺组织湿重/干重比差异无显著性（表1）。

    2.4 胰腺炎大鼠肺组织Fas、FasL的表达（图1～图4） Fas、FasL免疫组化染色阳性结果均为细胞浆/膜着色，呈棕黄色;胞核呈淡蓝色。正常对照组大鼠肺组织Fas、FasL免疫组化染色显示，肺组织形态结构正常，Fas、FasL几乎不表达;造模后1h组，免疫组化染色可见大鼠肺组织Fas、FasL呈弱阳性表达;随着时间的延长，大鼠肺损伤程度加重，4h、8h、12h肺组织Fas、FasL的表达逐渐增强，以24h表达最强。

　　3 讨论

　　1989年，美国的Trauth和日本的Yonehara所领导的两个科研小组分别从小鼠体内分离出对人体细胞系有溶细胞作用的抗体，他们把这两种抗体所识别的细胞表面蛋白分 别称为Fas和Apo-1（apoptosis first antigen） ［7］  。随后，蛋白纯化和分子克隆证实Fas和Apo-1为同一种分子。1993年，第5次国际CD分类会议将其定为分化抗原类的CD95。通过鉴定Fas蛋白的结构，证明其属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体/生长因子受体超家族，是I型膜蛋白，其分子量为45kD，其胞内段含有一段长约60～70个氨基酸保守序列的片段，与细胞凋亡有关，即死亡结构域（death domain，DD）。多种组织细胞可以表达Fas。Fas配体（Fas1igand，FasL）是Fas在体内的天然配体，属TNF家族，是一种Ⅱ型膜蛋白，能与Fas结合诱导细胞凋亡。表达FasL的组织细胞较少，一般是活化的淋巴细胞和免疫特权细胞（如眼、睾丸等） ［8］  。

    Fas/FasL系统是导致细胞凋亡的主要途径之一。Fas与FasL结合后，使Fas形成能够传递信号的三聚体，然后与一种具有死亡域的Fas相关蛋白（Fas associated protein with death domain，FADD）结合，并通过FADD N端的死亡效应结构域（death effector domain，DED或称MORTI结构域），将凋亡信号传递至凋亡蛋白酶-Caspase-8，从而引起Caspase家族的一系列酶联反应，激活的Caspase作用于不同的底物产生不同的效应，最终导致表达Fas的细胞发生凋亡 ［9］  。另外，Fas介导的细胞凋亡还可能通过神经酰胺作为第二信使 ［10］  或者通过有丝分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）的两个亚类JNK和EPK传递凋亡信号 ［11］  。Fas/FasL系统及其介导的细胞凋亡在急性肺损伤中起重要作用。研究表明，在ALI过程中Fas/FasL系统介导了多种细胞的凋亡，而且这些细胞的凋亡在ALI的不同时期作用各不相同 ［12，13］  。

    Savill等认为，Fas/FasL系统，通过减少中性粒细胞的渗出和促进中性粒细胞的凋亡，限制肺损伤的破坏程度，促进炎症的消散 ［14］  ;但是Herlihy等认为，ALl后，大量中性粒细胞凋亡伴有吞噬细胞吞噬能力下降，造成大量凋亡的PMN不能被及时吞噬清除，最终破裂释放毒性物质加重肺损伤 ［15］  ;而宋勇、毛宝龄等认为，ALI早期，Fas/FasL系统诱导支气管肺泡上皮细胞、血管内皮细胞凋亡而破坏肺泡—毛细血管膜的完整性，减少肺泡表面活性物质的合成，而加重肺损伤 ［16，17］  ;而地塞米松可以通过抑制炎性介质的释放，抑制Fas/FasL系统的活化，阻断、调控肺组织靶细胞凋亡以减轻肺组织损伤 ［18］  。Wang等通过对气道内滴入LPS诱导的大鼠肺损伤模型的研究发现，ALI时，肺内大量炎细胞浸润和肺泡Ⅱ型上皮细胞增生，原位凋亡研究显示，ALI第1天后即可检测到肺泡II型上皮细胞凋亡信号，并且呈弥漫性分布，至第7天时，凋亡达最高水平，然后逐渐下降;FasL主要表达于巨噬细胞和中性粒细胞，Westernblot分析显示，在ALI的第1天～第21天，FasL的膜结合形式及可溶性形式均有表达，而且在ALI第l周内表达最强;Fas表达于肺泡II型上皮细胞表面，ALI后3～5d达最高水平，此后，逐渐下降。Fas、FasL的表达先于肺泡II型上皮细胞的凋亡。急性期后，Fas、FasL表达减少，肺泡II型上皮细胞凋亡亦减少。因此认为，Fas/FasL系统参与了肺泡II型上皮细胞的增生的消退过程，在恢复期肺组织结构重建中起重要作用 ［19］本研究免疫组化染色结果显示，正常大鼠肺组织内Fas轻度表达，FasL几乎不表达;诱导胰腺炎后1h，大鼠肺组织内Fas/FasL表达即有增加，此后，Fas/FasL表达逐渐增加，至24h时表达最强;肺损伤病理评分显示胰腺炎诱导后大鼠肺损伤逐渐加重;提示，肺组织内Fas/FasL及其介导的细胞凋亡可能参与了胰腺炎肺损伤的过程。

    张刚等通过研究TNF-α基因表达、细胞凋亡与急性胰腺炎肺损伤的关系发现，急性胰腺炎时，肺内凋亡指数下降，认为肺内聚集的中性粒细胞延迟凋亡可能在肺损伤中起一定作用，而TNF-α过度生成可能是中性粒细胞延迟凋亡的部分原因;同时他们发现，AP并发肺损伤时，仅有少数肺泡上皮细胞和血管内皮细胞发生凋亡，因此认为，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞发生凋亡更可能是炎症过程中机体清除小部分受损的不易恢复的细胞的一种机制，而不是肺小血管和肺泡壁损伤的主要原因 ［20］  。

    有鉴于此，关于Fas/FasL以及其介导的肺组织内不同细胞、不同时期的细胞凋亡在胰腺炎肺损伤中的作用有待于进一步研究。

    （本文图略）

　　参考文献

    　1 刘光伟，龚守良.Fas基因与细胞凋亡.吉林大学学报（医学版）， 2002，28（1）:95-96.

    　2 Aho H J，KoskensaloML，NevalainnenTJ.Experimental pancreatitis in the rat:Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis.Scand J Gastroenterol，1980，15:411-416.

    　3 Schmidt J，Lewandrwsi K，Warshaw AL，et al.Morphometric characˉteristics and homogeneity of a newmodel of acute pancreatitis in the rat.Int J Pancreatol，1992，12（1）:41-51.

   　 4 Pozsar J，Berger Z，Simonk，et al.Biphasic effect of prostaglandin E  l  on the severity of acute pancreatitis infuced by a closed duodenal loop in rats.Pancreas，1996，12（2）:159-164.

   　 5 Hofbauer B，Saluja AK，Bhatia M，et al.Effect of recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase on two models of experiment acute pancreatitis.Gastroenterology，1998，115:1238-1247.

   　 6 Kogire M，Inoue K，Higashide S，et al.Protective effects of endothelin-1on acute pancreatitis in rats.Dig Dis Sci，1995，40（6）:1207-1212.

   　 7 姜泊.细胞凋亡基础与临床研究.北京:人民军医出版社，1999，30-33.

   　 8 Nagata S，Golstein P.The Fas death factor.Science，1995，267:1449.

　　9 Gerhing S，Rottmann S，Menkel AR，et al.Inhibition of proliferation and apoptosis by the transcriptional receptor Madl repression of Fas inˉduced caspase8activation.J Biol Chem，2000，275（14）:10413-10443.

    　10 Konopleva M，Zhao S，Xie Z，et al.Apoptosis，molecules and mechamisms.Adv Exp Med Bioi，1999，451:217-236.

    　11 Sabapathy K，Hu Y，Kallunki T，et al.JNK2is required for efficient T cell activation and apoptosis but not for normal lymphocyte developˉment.Curr Biol，1999，9（3）:116-125.

   　 12 Sutherland LM，Edwards YS，Murray AW，et a1.Alveolar typeⅡcell apoptosis.Comparative Biochemistry and Physiology（PartA），2001，129:267-285.

    　13 王颖，张淑文，王宝恩.急性肺损伤与中性粒细胞凋亡.中华急诊医学杂志，2001，10（5）:354-355.

    　14 Savill J，Healett C.Granulocyte clearance by apoptosis in the resolusion of inflammation.Semin Cell Biol，1995，6:335-339.

    　15 Herlihy JP，Vermeulen MW，Joseph PM，et al.Impaired alveolar macrophage function in smoke inhalation injury.J Cell Physiol，1995，163:1-8.

    　16 宋勇，毛宝龄.急性呼吸窘迫综合征患者肺组织Fas/FasL系统表达的变化及其意义.Chin Crit Care Med，1999，11（2）:96.

    　17 宋勇，毛宝龄，钱桂生，等.急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡及Fas/FasL系统表达改变及其意义.中华医学杂志，1999，11（11）:662-665.

    　18 宋勇，毛宝龄，钱桂生，等.地塞米松对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡及Fas基因与Fas基因配体系统表达的影响.中华结核和呼吸杂志，2000，23（1）:23-26.

    　19 Wang HC，Shun CT，Hsu SM，et al.Fas/Fas ligand pathway is involved in the resolution of typeⅡpneumocyte hyperplasia after acute lung inˉjury:Evidence from a rat model.Crit Care Med，2002，30（7）:1528-1534.

    　20 张刚，修瑞龄，杨训，等.肿瘤坏死因子-α基因表达、细胞凋亡与急性胰腺炎肺损伤关系的实验研究.中华消化杂志，2002，22（1）:22-25. 

　　作者单位:1　100054首都医科大学附属北京佑安医院肝胆外科
  
　　　　　　 2　首都医科大学宣武医院普外科 

　　（收稿日期:2004-09-20） （编辑江 风）