抗CD34单抗标记血管生成在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

抗CD34单抗标记血管生成在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

免疫学杂志 2000年第4期第16卷 临床免疫学

作者：温剑虎　朱冰

单位：温剑虎（重庆医科大学附属第一医院胸外科，重庆　400016）；朱冰（重庆医科大学附属第一医院胸外科，重庆　400016）

关键词：非小细胞肺癌；血管生成；免疫组化；微血管密度

　　［摘　要］　目的　探讨非小细胞肺癌中CD34标记的血管生成的表达及临床意义。方法　采用免疫组化法检测81例手术切除的非小细胞肺癌标本中抗内皮细胞表面抗原CD34单抗标记的血管生成。结果　CD34以其染色的特异性、敏感性及清晰的背景而易于识别。统计学分析显示微血管密度同肺癌临床分期的进展及血行转移密切相关，但未发现同淋巴结转移及其它临床病理特征有关。结论　肺癌中微血管密度对血行转移的进展有重要作用且同肺癌的发生有关。

　　［中图分类号］　R734.2 　　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］1000-8861（2000）04-0289-03

Expression and clinical significance of angiogenesis labelled by anti-CD34 monoclonal antibody in non-small-cell lung carcinoma

WEN Jian-hu， ZHU Bing

　　（Department of Thoracic Surgery，the First Hospital of Chongqing University of Medical Science，Chongqing 400016，China）

　　［Abstract］ Objective To study expression and clinical significance of angiogenesis labelled by anti-CD34 monoclonal antibody in non-small-cell lung carcinoma．Methods Non-small-cell lung carcinoma tissue were obtained postoperatively from 81 patients with lung carcinoma．Immunohistochemical detection of tumor-associated microvessels was performed using anti-CD34 monoclonal antibodies directed against endothelial markers．Results Staining of CD34 was easy to identify because of its specificity，sensitivity and clear background．Statistic analysis showed：the microvessel count was significantly related to the development of disease and hematogenous metastasis but did not correlate with the development of nodal metastasis and other clinicopathologic characteristics．Conclusion Tumor vascularity is important for the development of hematogenous metastasis and correlates with lung carcinogenesis．

　　［Key Words］ non-small-cell-lung carcinoma；angiogenesis；immunohistochemistry；microvessel density

　　肿瘤的生长和转移是一个复杂的多步骤过程，受诸多因素的影响。近年研究发现，实体癌的生长和转移需要持续的血管生成，并为肿瘤发生远处播散提供血行转移途径，影响到患者的预后^［1］。而血管生成强度，即组织切片中微血管密度（microvessel　density，MVD）或微血管计数，是判断肺癌生物学行为的有效指标。本研究应用免疫组化S-P法检测肺癌组织中血管内皮细胞膜抗原CD34的表达状况，对微血管密度进行人工计数定量分析以反映其血管生成状况，探讨原发性肺癌组织中血管生成的临床意义及其变化规律。

　　1　材料与方法

　　1．1　临床资料　选用1991～1998年间重庆医科大学附属第一医院胸外科手术切除后经病理诊断为原发性非小细胞肺癌（non-small-cell　lung　carcinoma，NSCLC）石蜡包埋组织标本81例，其中腺癌31例，鳞癌50例；男性62例，女性19例；年龄为30岁至78岁，平均55.7岁；肿瘤最大直径为2～8　cm，平均4．55　cm；外科病理分期采用1986年国际抗癌联盟（UICC）制定的肺癌分期系统及1997年第八届国际肺癌大会制定的分期补充标准^［2，3］，其中Ⅰ期13例，Ⅱ期34例，Ⅲ期34例；病理学分级为G₁　12例，G₂　41例，G₃　28例。术后随访78例，其中1例6月后B超及CT示肝转移；1年后出现肾上腺转移2例，骨转移9例，脑转移2例；2年后出现骨转移12例，脑转移3例，肝转移3例。

　　1．2　免疫组化染色主要步骤（S-P法）　全部标本均为10％中性福尔马林固定，石蜡包埋组织，制成5　μm厚切片，切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精至水化；3％甲醇双氧水浸泡；0.125％胰酶消化，非免疫性动物血清封闭，兔抗人CD34单克隆抗体，室温下孵育60　min；生物素化二抗，37　°C　10　min。链亲和素-过氧化物酶溶液室温孵育10　min，DAB镜下控制显色，苏木素复染，中性树胶封片（以上试剂均购自福建迈新公司）。

　　1．3　CD34结果判定标准　阳性标准为由内皮细胞形成的条状及隙状等孤立或簇状结构棕黄染色及有管腔者，管腔小于8个红细胞大小的均记为一条血管，相互分离的内皮细胞按1条血管计数，血管腔大于8个红细胞或管壁可见平滑肌者不计入内^［4］。

　　1．4　计数方法　结果判定在双盲法下进行，且每张切片由两名病理医师分别计数。先于低倍光镜（×40和×100）下确定3个血管着色最密集区域，然后在200倍视野下计数微血管，取3个视野的均值作为MVD。两人计数差10％以上者重新计数。肿瘤内的硬化区域、肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计数^［4］。

　　1．5　统计学分析　计量资料以

　　2　结果

　　2.1　肺癌组织中的微血管染色状况　本研究采用抗CD34单抗对81例肺癌组织中微血管密度进行免疫组化染色，结果显示癌巢及癌细胞密集区，MVD显著少于癌周区域及增生活跃区域，且癌巢与坏死组织间血管生成较多，坏死区血管完全破坏。

　　2.2　肺癌组织中的微血管计数　全组81例标本平均微血管计数为43．75±16．67条，实际值范围为19～96条。由表1可见，血行转移组与无血行转移组间存在非常显著性差异（P＜0.005）。本研究未看出微血管计数与年龄、性别、淋巴结转移、组织类型、病理学分级以及肿瘤最大直径等因素有关，但在与肿瘤浸润度的研究中发现，T₁与T_2－4组微血管计数存在非常显著差异（P＜0.01），两两比较结果显示：T₁与T₂组间存在显著性差异（P＝0.009），且随肺癌浸润度增加，各组间微血管计数依次上升；TNM分期间亦有类似趋势，Ⅰ－Ⅱ期与Ⅲ期组间观察到显著性差异（P＜0.05）。

表1　　NSCLC患者微血管计数与临床病理特征的关系

　　Tab1　Relationship between microvessel counts and clinicopathologic characteristics　in　81　cases　patients　of　non-small-cell　lung　carcinoma

variables	number　of 　　cases	microvessel 　　counts	range	P
age（year）				0.21
＜60	48	45．64±18.09	19～96
≥60	33	41．06±14．25	21～81
sex				0.48
male	62	43．10±17．13	19～89
female	19	46．11±15．65	29～96
histological　types				0.86
squamous	50	44．02±16．46	19～89
adenocarcinoma	31	43．32±17．30	23～96
pathological　grading
G1	12	39．08±18．34	20～79	0.44①
G2	41	43．65±14．60	19～89	0.60②
G3	28	45．89±18．82	23～96	0.33③
tumor　sizes（cm）				0.89
≤3cm	16	44．40±20.47	21～96
＞3cm	65	43．60±15．85	19～89
TNM-T（T-status）				0.005
T1	28	37．01±14．06	20～74
T2－4	53	47．35±16．98	19～96
nodal　metastasis				0.77
negative	28	43．04±15．49	19～79
positive	53	44．13±17．41	20～96
clinical　stage				0.04
Ⅰ－Ⅱ	47	40.51±15．75	19～79
Ⅲ	34	48．36±17．10	28～96
hematogenous　metastasis				0.0001
positive	32	53．16±17．09	21～96
negative	48	37．48±13．20	19～81
clinical　stadge
Ⅰ	13	38．54±16．14	21～79
Ⅱ	34	41．26±15．77	19～78
Ⅲ	34	48．36±17．10	28～96
TNM-T（T-status）
T1	28	37．07±14．06	20～74
T2	45	46．78±16．10	19～89	0.009
T3－4	8	51．00±23．04	29～96

　　①　group　G₁：G₂；②　group　G₂：G₃；③　group　G₁：G₃

　　：The　result　showed　a　significant　difference　between　group　T₁　and　T₂　in　microvessel　counts．3　讨论

　　1971年FOLKMAN提出“肿瘤的生长与扩散取决于血管生成”这一概念，近年来大量实验和临床研究证实：恶性肿瘤的生长和转移与肿瘤新生血管生成密切相关。肿瘤的血管生成不仅为肿瘤组织的生长提供营养及气体交换，同时也成为肿瘤细胞转移的最直接的门户^［5］。尽管许多研究表明不同类型肿瘤中肿瘤相关血管生成同肿瘤的生长、转移、复发、生存期等关系密切，但由于MVD不能精确计数，结果也很不稳定。由于肿瘤血管生成机制复杂，采用免疫组化方法标记微血管来反映血管生成并提供有价值的信息已被大多数研究所认可。肿瘤相关血管生成的免疫组化研究是用针对血管内皮细胞（EC）标志物的抗体（抗FVⅢ-RA、CD31、CD34等）完成的。近来报道CD34抗体对肿瘤内毛细血管、小血管EC稳定性及敏感性较强，有较强的可重复性^［6］，故本研究采用抗CD34单抗来研究NSCLC中血管生成状况。

　　研究表明：在许多实体瘤中，包括胃肠道肿瘤、子宫颈癌、鼻咽癌、乳癌等，都存在着活跃的血管形成，并发现其血管生成的活跃程度同这些肿瘤的发生、发展及预后相关。本组资料显示81例肺癌组织平均MVD为43．75±16．67，肿瘤周边与正常组织交界处的浸润区域、增生活跃区域的间质中存在着显著高于癌肿中心的血管生成。随着肺癌的分期进展，Ⅰ－Ⅱ期与Ⅲ期组间血管生成存在显著性差异。微血管计数随浸润程度的进展也有类似倾向，T₁组与T_2～4组间的显著性差异提示肺癌进展过程中血管生成的增加起到了一定的促进作用。近来研究报道在胃癌及黑色素瘤中^［7，8］，肿瘤血管生成与血行转移相关，但与淋巴结转移无关。尽管MACCHIARINI等报道^［9］NSCLC中MVD与转移性疾患显著相关，但没有确切证据表明与独立转移模型有关。另有报道^［10］NSCLC中淋巴结转移与远处转移均与血管生成有显著相关，但其是用抗FVⅢ-RA进行标记。在本研究中血行转移及淋巴结转移资料均为术后获取，并用抗CD34单抗来标记微血管生成。研究结果显示，32例出现血行转移者平均微血管计数为53.16±17.09，未出现血行转移的49例平均微血管计数37.48±13.20，单变量分析两组间存在显著性差异（P＝0.0001），表明原发性NSCLC新血管生成同血行转移显著相关，这一发现同近来报道一致^［11］，即肿瘤中血管生成扩大了血管内皮的表面积，增强了肿瘤细胞进入微循环的趋势。本研究结果未能看出血管生成同年龄、性别、肿块大小、吸烟状况以及淋巴结转移等因素有关。

　　尽管NSCLC患者术后5年的复发率为20％～40％，但通常Ⅰ期NSCLC患者仅单独行手术治疗，因此进一步观测早期NSCLC患者血管生成状况与术后复发、转移及预后的关系对于那些期望单独手术治愈的早期癌症的疗法选择具有潜在的决定性^{［12～14］}。

　　肺癌的转移是一个复杂的过程，与血管生成之间的关系并不十分明了，但血管生成确实为肺癌的浸润、转移提供理想通道，因此抑制肺癌血管生成进而抑制肺部肿瘤的浸润转移将为临床治疗提供良好的支持。而微血管计数作为血管生成活性或强度的定量指标之一，对于血管抑制药物的疗效检测十分有用，又与正性或负性血管生成因子存在很大相关。因此，MVD与肺癌的生长和复发、转移之间存在着必然的、内在的规律性，通过MVD的测定，将为揭示肺癌生长和扩散的规律探讨新的方向。

　　［基金项目］　重庆市科委科技攻关项目（98028）

　　［作者简介］　温剑虎（1954－），男，陕西西安市人，副教授，硕士，主要从事胸部肿瘤的外科治疗。

［参考文献］

　　［1］ BOSARI S，DELELLIS RA，HEALTLEY GJ．Micro-vessel quantitation and prognosis in invasive breast carcinoma［J］．Hum Pathol，1992，23（7）：755－758．

　　［2］ MOUNTAIN CF．Revisions in the international system for staging lung cancer［J］．Chest，1997，111（6）：1 710－1 717．

　　［3］ MOUNTAIN CF，DRESLER CM．Regional lymph node classification for lung cancer staging［J］．Chest，1997，111（6）：1 718－1 723．

　　［4］ WEIDNER N．Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors．Breast Cancer Res Treat，1995，36（1）：169－173．

　　［5］ GURDI AJ，FISCHER L，HARRIS JR，et al．Mi-crovessel density and distribution in ductal carcinoma in situ of the breast．J Natl Cancer Inst，1994，86（8）：614－619．

　　［6］ TRAWEEK ST，KANDALAFT PL，MEHTA P，et al．The human hematopoietic progenitor cell antigen（CD34）in vascular neoplasia［J］．Am J Clin Pathol，1991，96（1）：25－31．

　　［7］ WEIDNER N，CARROLL PR，TLAX J，et al．Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma［J］．Am J Pathol，1993，143（2）：401－409．

　　［8］ TANIGAWA N，AMAYA H，MATSUMURA M，et al．Tumor angiogenesis and mode of metastasis in patients with colorectal cancer［J］．Cancer Res，1997，57（6）：1 043－1 046．

　　［9］ MACCHIARINI P，FONTANINI G，HARDIN MJ，et al．Relation of neovascularization of metastasis of non-smalll-cell lung cancer［J］．Lancet，1992，340（1）：145－146．

　　［10］ FONTANINI G，BIGINI D，VIGNATI S，et al．Mic-rovessel count predicts metastatic disease and survival in non-small-cell lung cancer［J］．J Pathol，1995，177（1）：57－63．

　　［11］ FOLKMAN J．Angiogenesis and breast cancer［J］．J Clin Oncol，1994，12（3）：454－466．

　　［12］ NESBITT JC，PUTNAM JB，WALSH GL，et al．Survival in earlystage non-small-cell lung cancer［J］．Ann Thorac Surg，1995，60（2）：466－472．

　　［13］ GINSBERG RJ，RUBINSTEIN LV．Randomized trial of lobectomy versus limited resection for T₁ No non-small-cell lung cancer study group ［J］． Ann Thorac Surg，1995，60（3）：615－623．

　　［14］ MARTINI N，BAINS MS，BUTT ME，et al．Incidence of local recurrence and second primary tumors in resected stage Ⅰ lung cancer ［J］． J Thorac Cardiovasc　Surg，1995，109（1）：120－129．

［收稿日期］　2000-01-21； ［修回日期］　2000-04-19