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于小洋1 辛 楠2 （1 北京朝阳医院检验科 100020；2 北京军区总医院优生优育中心）
自从1989年正式确认丙型肝炎病毒(HCV)以来已经过去16年,对丙肝的研究已经取得比较大的成就,但是丙型肝炎对人类健康的威胁仍在日益显现。据WHO统计,全球HCV的平均感染率为3%,约有1.7亿人受染，而每年新感染者达3.5万。我国平均感染率为3.2%，北方稍高约4.6%，南方为2.6%～2.9%，感染人数估计有3700万。受感染的母亲传播给婴儿的发生率约为5%。患急性丙型肝炎后约有55%～85%的患者可变成慢性丙型肝炎，其中5%～20%的人20～25 年后可发展为肝硬化，肝硬化患者10年内30%发展为终末期肝病［1-2］。
与检测乙型肝炎病毒（HBV）相比，HCV的检测还有许多难题待解决。目前存在的主要问题有：由于HCV抗原结构的特殊性，直接检测血清中HCV抗原的技术还没有彻底解决；抗体（抗-HCV）出现时间晚,从HCV感染后到抗体转阳的时间平均为50～70天，有的患者可延长至6～9 月，因此这一时期又被称为容易漏检的“窗口期”；病毒基因型复杂而且容易变异，使基因水平的检测质量不够稳定。
鉴于上述原因，提高丙型肝炎病毒检测质量一直是医学检验领域中的重要课题。随着近年来有关人员的不；断努力和相关科学的发展,已经在HCV的检测质量方面有了重要进展。
1 关于第三代抗-HCV试剂的应用
检测丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）仍是目前常用的手段，这方面的检测方法主要是第三代酶免疫测定法(EIA)或间接酶联免疫法(ELISA),我国大多采用ELISA方法。
第三代ELISA试剂比第一、二代试剂有明显的改进，其基本原理是以HCV抗原包被酶标板，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与被检血清中的抗-HCV反应,邻苯二胺(OPD)或3，3’5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色后,根据颜色的深浅进行阴阳性判断。该方法中包被抗原的组成和质量是关键因素。与之相比，第一代抗-HCV ELISA采用的抗原C100-3是HCV非结构基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶(SOD)基因嵌合后表达的融合蛋白，由于C100只含363个氨基酸，而HCV基因组编码的蛋白有长达3010个氨基酸,因此C100-3抗原-抗体系统只代表整个HCV抗原-抗体系统的一小部分，所以敏感性不高；抗C100-3出现也太晚,不适于早期诊断。第二代抗-HCV ELISA在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c,使检出率提高25%～30%，而且检测抗体的窗口期有所缩短，但由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题和少数漏检问题。当前用的第三代抗-HCV ELISA试剂，其包被抗原为HCV核心抗原，NS3、NS4和NS5抗原，使特异性达到99%［3］。
虽然第三代HCV抗体ELISA试剂增加了HCV NS5区表达的蛋白作为抗原,提高了试剂敏感性，但是从HCV感染到可检测出抗体（窗口期）通常还需平均40多天,因此,第三代ELISA试剂的质量仍需提高和改进。例如在筛查实验的特异性方面，丙肝抗体酶联免疫检测试剂的特异性并不如想象中的高，并经常出现假阳性结果。对强阳性或弱阳性样本检测，国产试剂(主要厂家)的S/CO值高于进口试剂，但是无论对阳性及阴性样本检测，国产试剂(主要厂家)的CV值及特异性均明显低于进口试剂，以致出现更多的假阳性结果。此外，丙肝抗体酶免检测试剂皆没有灰区的设定，S/CO比值较低(但大于1)的结果也报告阳性,亦是假阳性比较多存在的原因［4］。
为弥补这些问题，一些实验室在使用补充实验。国外使用重组免疫印迹试验(recombinant immunoblot assay，RIBA)，其抗原包括:C22-3、C33c、C100-3和克隆5-1-1共4种。RIBA是抗-HCV试剂的补充试验，使抗-HCV的结果更准确。在献血人群的筛查中，由于抗-HCV的阳性预测值远低于实际情况，所以免疫印迹检测可应用于献血人群的筛查。在美国和欧盟,曾一度出现以HCV RNA检测替代免疫印迹试验的趋势，但因其成本-效益问题，所以，美国疾病控制中心（CDC）又重新提出免疫印迹检测的应用。我国HCV抗体检验实验室亦应尽快执行国家CDC推荐的HCV实验室检验方法，达到既减少HCV抗体检验结果报告的假阳性数，又使检验结果的可信度提高［5-6］。相信在此方面会有不断的发展。
2 关于丙型肝炎病毒RNA的检测
虽然HCV感染后到出现抗体有一个较长的窗口期，平均为50～70天，但HCV基因组的复制出现却很早,感染后数天即出现病毒血症。因此直接检测HCV RNA对于早期诊断HCV是重要的。
目前用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清中的HCV RNA,包括定性和定量两种方法。RT-PCR其基本原理是:首先经逆转录酶作用,在特异性引物存在下，将HCV RNA逆转录为单链的cDNA,再通过PCR将cDNA扩增、定性PCR的灵敏度高于定量PCR。罗氏公司的定性PCR的灵敏度为50 kIU/L，定量PCR为600 kIU/L；拜尔公司的定性PCR(转率介导扩增法，TMA)试剂的灵敏度为10 kIU/L，其定量PCR为615 kIU/L。定性PCR检测主要用于急慢性丙型肝炎诊断，而定量PCR则用于疗效监测。不同定量分析方法中的检测单位与临床标本的HCV RNA实际水平的关系不完全一致，世界卫生组织制定了HCV RNA定量分析单位的国际标准(IU),目前的下限值范围为30～615 kIU/L，上限值范围为5×105～7.7×105 kIU/L，特异性为98%～99%，且不受基因型的影响［7］。
RT-PCR技术有许多优点:（1）特异性强。抗-HCV阳性不能直接说明受检者体内当时HCV是否存在，而PCR所检的HCV RNA可作为有无传染性的直接指标。（2）敏感性高。可发现抗-HCV阴性者HCV感染。（3）阳性出现早。 可在ALT增高的同时检出。黑猩猩感染HCV后第三天即可在血清中检出HCV RNA。 (4)应用较广泛。可用于检测血液、组织和体液中的RNA。
RT-PCR方法也存在不足：操作程序较复杂，技术要求严格，干扰因素多，影响检测效果。主要有以下原因：HCV在血液和肝组织中的感染滴度很低,且有一定波动性；HCV RNA易被血细胞中的RNA酶降解,因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果；HCV RNA还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检出率。RT-PCR的多步骤实验中任何步骤的问题均易影响其检出。该方法也容易因污染而出现假阳性。因此RT-PCR方法难以在常规工作中或基层实验室推广。在RNA病毒RT-PCR检测中，影响试验过程的因素较多,如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂的问题等,这些因素均可能影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此,PCR测定必须使用质控品进行严格的室内质量控制才能保证结果的可靠性；此外,进行定量测定，必须有定量的标准品或内标,内标还可起到单管即时质控的作用。 一个稳定可靠且无生物传染危险性的RNA质控品和标准品,对于保证RNA病毒的RT-PCR检测质量具有重要意义。在这一点上，裸露的RNA病毒颗粒及病毒替代品均难以作为理想的质控品的标准品,而采用分子克隆和原核表达方法构建的内含特定病毒RNA 片段的噬菌体病毒颗粒则能较好地解决这些问题,其不但对于RNA病毒RT-PCR检测的标准化，而且对于特定的mRNA的检测等均有着潜在的应用价值［8］。
应用转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification,TMA)可以提高RNA的检测效率。TMA是用动物模型的白血病病毒的逆转录酶和T7 RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统,主要扩增原理为: 目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录,逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在1个试管中进行,也减少了污染。该检测方法可以检测到极低水平的HCV RNA，达到5～10IU/ml的水平，这是RT-PCR方法无法达到的［9］。
3 关于HCV抗原的检测
多年来，专业人员一直在探索能够直接检测HCV抗原,如果能够实现这种检测手段，检测丙肝病毒就有可能象检测乙肝病毒那样可参考的指标更多，还能够有效缩短窗口期。但由于HCV抗原的特殊性和相关抗体制备中存在的困难,使这方面的进展受到障碍。
近几年来经过专业人员的不断努力,在检测血清中HCV核心抗原方面有了乐观的进展。丙肝病毒核心蛋白约含190 aa,其氨基酸序列十分保守，比较已有的HCV各分离株的氨基酸序列，其同源性超过95%，在病毒增殖及发病机制中起重要作用，是HCV感染的重要标志［3］。
研究显示HCV核心抗原水平与HCV RNA水平相关。在血清转换之前，核心抗原的检测比HCV RNA平均迟1～2天，核心抗原和HCV RNA的动力学变化密切相关，可以作为HCV复制的标志。用EIA法可以检测和定量分析HCV核心抗原。据估算，1pg完整的HCV核心抗原大致相当于8000IU的HCV RNA。由于方法敏感性的限制，HCV RNA水平低于20000IU/ml时不宜采用检测HCV核心抗原的方法。 HCV核心抗原在外周血中有游离抗原与总抗原两种状态，前者存在于抗-HCV转阳前，在抗-HCV出现后，所测定的HCV抗原为总抗原［7，9］。
1999年Aoyagi建立了一种不需要特殊仪器设备的简单、高灵敏度的酶免分析法用于检测血清中的HCV核心抗原，在该方法中先用3种去垢剂(TritonX-100，CHAPS和SDS)预处理被检标本，即有效灭活标本中的核心抗原抗体,检测结果不受血清样品中的抗凝剂或血液因子的影响,实验中125名健康人群和50例乙肝患者的HCV核心抗原检测均为阴性,而73例抗-HCV阳性患者中HCV核心抗原检出率为78.1%(57/73)，与HCV RNA也有很好的相关性(r=0.8，P<0.001)［10］。
美国Ortho 公司已推出了用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原ELISA试剂，其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后所获得的纯化抗HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物,用与固相包被物有不同抗原决定簇的抗-HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧化物酶标记物，与血清中总的或游离的HCV核心抗原反应，OPD显色后进行定性或定量测定。该法不受被测样品中抗-HCV的干扰，检测结果准确可靠，与RT-PCR方法相比具有方法简单、时间短、对环境要求低以及假阳性率低的特点,在临床上可用于HCV血清学转换前的早期急性丙型肝炎诊断、 抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析等［11］。2003年在法国巴黎召开的关于HCV核心抗原检测技术的第一届专题会议认为,该试剂对HCV核心抗原的检出比抗-HCV的检出早约49天，可用于供血员的筛查，这将显著提高输血的安全性，Ortho公司的该试剂已于2004年4月在欧洲上市，目前正在申请得到美国食品和药物管理局(FDA)的批准［3］。我国已经有厂家和科研单位合作进行这方面的试剂开发，如湖南景达生物工程有限公司和中国军事医学科学院联合研制开发的丙型肝炎病毒核心抗原诊断酶联免疫试剂盒已获得国家食品药品监督管理局颁发的证书，有望投入市场。
十几年来一些学者曾经试图建立血清中各种HCV抗原的检测方法,但由于血液中HCV抗原含量太低，用常规方法无法检出。近年来由于HCV单克隆抗体的研制成功,已有国内外学者发表了肝组织及人体分泌物中HCV抗原检测成功的报道。如果能加强对HCV中和抗体wv、抗-HCV-IgM、抗-HCV 核心抗体的研究［12-13］，进一步开发对血清及肝组织内HCV抗原的测定,可能会在丙肝的实验诊断方面取得更大进展。
提高HCV检测质量是未来肝炎预防领域的重要任务,虽然这方面的困难还不少,但正在出现好的前景。
参考文献
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（收稿日期：2006-01-11）