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丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病原Ⅲ 。1989年9月在东京召开的国际非甲非乙型肝炎会议上正式命名此种病毒为丙型肝炎病毒(HCV)，由HCV引起的肝炎称之为丙型肝炎(HC)。
1 HCV基因的特点
HCV是一种新的病毒类型，属于单股正链的RNA病毒，其基因组编码多肽与其他病毒序列之间整体同源性较小，然而几组实验结果表明，HCV是人类黄病毒。首先HCV 5末端区域与瘟病毒的对应区域有较多的同源性(45 ～49 )，而HCV多肽的亲水性同黄病毒多蛋白很相符，且三者的基因结构和功能也很相似。这与近来把它们分类为黄病毒中3个不同的属相一致。HCV与瘟病毒、黄病毒的亲缘进化关系，可能促进未来有关HCV感染的生物学研究，亦可能有助于一些重要问题
的解决，如：HCV非输血传播途径中可能涉及的媒介、某种细胞作为病毒储存库的可能性、是否存在病毒基因在宿主基因的整合导致慢性化、是否存在通常的嗜肝外的不同细胞的新嗜性引起临床表现的多样化、以及是否存有抗体依赖性加强现象等。此外，黄病毒减毒活疫苗的成功，为HCV重组疫苗的开发提供了乐观前景。
2 HCV株型的序列分析
自从1989年Choo报道HCV部分序列(731Obp)以来，许多研究者已完成了多个HCV全基因或基因片段分析。从已有的数据看，这些不同克隆的核苷酸(nt)有很大差异，同源性从57 ～92 不等。不同型克隆间核酸同源性小于80 ，同型各株间甚至同一个HCV携带者分离出的基因克
隆之间也有一些差异。Ogata从同一患者血清分离到的1979年株与1990年株进行比较发现，在4 923个nt中就有123个不同。有人认为HCV核酸序列随着时间推移而变化以逃避宿主免疫系统。1991年岗本公布了Et本HCV亚型分类，HCV各株之间包膜蛋白与序列有26 ～44 不同。因此分为HCJ 、HCJ 、HCJe和HCJ，4种株型。Et本HCJ最多，美国HCJ 最多。
3 HCV感染的实验诊断
El前用于HCV感染的实验诊断方法主要有两种，检测抗一HCV 和HCV RNA。
3．1 抗一HCV检测
1989年5月，美国Chirob公司用分子克隆法分离到一个能表达NANB肝炎病毒特异性蛋白的cDNA克隆5-1—1。又将3个与5-1—1有共同ORF的重叠克隆连接起来建立了另一个克隆C100 。C 100与超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母中重组表达的多肽即C oo一。。完整的C·oo一。多肽的N端有154个SO D氨基酸，5个由EcoR I位点人工接头表达的氨基酸和363个HCV C100。cDNA编码的氨基酸；在其C端还有5个MS2的氨基酸。HCV C oo一。抗体检测系统，是最早应用的检测方法。世界各地关于HCV在各种人群中的感染率，基本上都是来自这种试剂盒的检测。检测结果证明，HCV是世界上几乎所有输血后非甲非乙型肝炎和部分散发性非甲非乙型肝炎的病因病毒。由于Cloo只含363个氨基酸，而HCV基因组编码的蛋白有长达3 010个氨基酸。因此C1oo一。抗原一抗体系统只代表整个HCV抗原抗体系统的-4'部分，所以敏感性不高，抗C100。一。出现也太晚，不适于早期诊断，且有些病人根本不出现。该方法使用的抗原含SOD融合蛋白，因此当人体存有抗一SOD时常常出现假阳性。但采用RIBA方法能排除因C 100。一。抗原中含SOD部而引起的假阳性反应，常被用作确认实验。第一代的RIBA-1试剂，含有C1oo一。、5-1—1两种抗原(包括SOD序列)，同ELISA相比特异性明显提高，避免了假阳性，但灵敏度都降低了。第二代RIBA-2试剂含有四种抗原。在C 100-3。、5-1-1基础上又增加了两个抗原。C(NSa区)和C2z一。(C区)使用多个抗原之后，不仅提高了检测特异性，而且大大提高了灵敏度，对于ELISA方法检出的可疑或弱阳性样本，尤其适用RIBA方法做确认实验。随着HCV基因序列的阐明，人们发现C区基因编码蛋白较E区和某些非结构区蛋白都保守。因此，用C区基因产物检测HCV抗体显得更加合理，于是相继建立了一些新的检测方法，试图克服C100。抗原的某些缺陷，称之为第二代抗一HCV试剂。第二代重组基因多肽检测抗一HCV的ELISA技术是在原包被抗原加入了核心抗原C2z一。、C o、C o。和第一代试剂 (C100—3)相比，第二代试剂具有检出率高(可提高25 ～30％)，而且抗体出现提早到16～60天。由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗一SO D造成的假阳性，于是人们开始采用人工合成肽段建立检测抗一HCV的新试剂。用中国北方地区HCV全基因序列，根据文献开发的预测蛋白理化性质及二级结构和抗原决定簇可能位点的序列软件，完成了HCV全基因序列的亲水性、亲近性、移动性分析，已预测到HCV抗原决定簇的位点。先对研制的C区3个寡肽(CPA、C e、CPzo)进行了抗原活性比较并初步应用于临床，同时与日本基因工程C区表达多肽C 进行比较。CP8+CP。e阳性率与C 的阳性率无明显差异，符合率为87．6 。用所建立的双PCR试验，比较82例抗一CP与HCVRNA的检测结果，符合率为87．5 。许多国家的经验证明，对献血员进行抗一HCV测定，可大大降低输血后患丙肝的风险[20]，降低丙型肝炎的发病率 ]。因此HCV检测可成为早期感染的检测指标[7 ]。
3．2 HCVRNA的检测
聚合酶链反应是目前分子生物学中最敏感的方法，样品中只要有一个拷贝的HCV 序列就有可能被检出。由于HCV在被感染者体内浓度很低，逆转录RNA PCR(RTPCR)才能检测到血清中的HCV RNA。PCR技术有许多优点：(1)特异性强。抗一HCV阳性不能直接说明受检者体内当时HCV是否存在，而PCR所检的HCVRNA可作为有无传染性的直接指标。(2)敏感性高。可发现抗一HCV阴性者HCV感染。(3)阳性出现早。可在ALT增高的同时检出。黑猩猩感染HCV后第3天即可在血清中检出HCV RNA。(4)应用较广泛。可检测组织和体液中RNA。但操作程序较复杂，技术要求严格，试验成本高，所以只限于有条件的实验室使用。1991年由北京医科下学肝病研究所建立了一项直接检测HCV PCR的双重PCR法，亦可称“一步法”。特点是微量(可从100~1血清中提到RNA)、简便(不用低温超速离心机等设备)、快速(从提取RNA逆转录可在4小时完成)、减少Rnase污染，1～2天内可发报告。由于PCR的诸多优点，只要不断的改进方法，使之更趋简便、快速，必将成为HCV感染诊断的重要手段。最近有研究结果表明，在原RT—PCT的基础上再进行定量PCR，其方法是在样品PCR反应混合液内加入。HdTTP掺入，液闪法测定。H掺入的CPM值以纯化已知浓度的cDNAsfuw(
10pg／每管30UI)，再计算待测血清中RNA的动态变化。初步研究结果发现，在治疗前后血清中RNA的深度变化较大。2例病人用a一干扰素治疗的病人中，虽然血清AI 转为正常，但血清中的RNA含量变化不大。提示该方法对丙型肝炎的疗效观察有一定的参考价值。
目前各厂家出售的抗一HCV试剂盒，其间的试剂的灵敏度、特异性存在一定的差异 ，分别由重组基因多肽人工合成多肽组成，基因工程多肽的优点是：(1)可包含多个抗原位点。(2)一旦克隆表达成功则产量高、价格低。(3)表达多肽的稳定性好。(4)可将几个片段重合使用，有较高的特异性和敏感性。(5)纯化简单，无其它蛋白干扰，可做抑制试验。缺点是：(1)克隆表达技术要求较高，不易达到满意结果。(2)表达产物纯化困难，含有菌体等其它蛋白干扰。(3)每批产量间稳定性比间差异小。合成的EP27及其检测结果，提示了它与第二代抗一HCV试剂的不同点 。
参考文献
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