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巨细胞病毒(CMV)感染是免疫功能低下者常见的机会感染。器官移植或骨髓移植者因接受大剂量免疫抑制剂或肿瘤化疗等，机体细胞免疫功能降低，可引起体内潜伏的CMV病毒激活，可导致严重的CMV病如间质性肺痰、肝炎、器官移植物损伤等，甚至可引起死亡。如移植后发生CMV肺炎则死亡率可达80～90%。目前抗CMV病的重点是预防性抗病毒治疗，Pre-emptive治疗是指检测到CMV亚临床感染的证据或针对CMV感染高危者行抗病毒治疗。早期检测到活动性CMV感染是Pre-emptive治疗的先决条件。众所周知，常规病毒培养需4周才能获阳性结果；ELISA法检测CMV特异性IgM抗体可用于免疫功能正常的CMV活动性感染或CMV病的诊断，但其阳性率低，在严重免疫抑制患者可缺乏抗体反应或抗体延迟出现。巨细胞病毒PP65白细胞抗原血症较特异性IgM抗体出现早，也优于病毒血症立即早期抗原(IEA)的检测，5小时可获结果。
本研究目的旨在采用巨细胞病毒PP65白细胞抗原血症检测作为细胞免疫功能低下者并发活动性CMV感染和CMV病的预测指标，并前瞻性观察PP65抗原阳性细胞数的变化指导并判断抗病毒治疗的效果。
试验对象和方法：
一、试验对象：
1999年9月至2000年4月北京协和医院和307医院收住的骨髓移植患者36例，包括异基因骨髓移植(Allo-BMT)26例，外周血干细胞移植(PBSCT)10例。健康对照组10。
二、方法：
骨髓移植前采用ELISA法检测患者CMV特异性IgG和IgM抗体，移植后3周起或入院后采用CMV Brite试验盒每周检测一次CMV PP65抗原，直到移植后100天或治疗后PP65抗原阴转、死亡或出院。异基因骨髓移植患者第一次检测到CMV PP65抗原阳性细胞即开始更昔洛韦抗病毒治疗，外周血自体干细胞移植患者则在出现症状后用药。
三、间接免疫荧光检测方法：
1.CMV抗原阳性和阴性对照玻片由试剂盒提供。
2.抗PP65单克隆抗体：
抗PP65单克隆抗体C10/C11(IgG)为FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白，PP65是CMV病毒的低基质磷蛋白，为CMV病毒最丰富的蛋白。本试验所用一抗为C10和C11单克隆抗体的混合物，二株单克隆抗体分别针对PP65不同的抗原决定簇以提高检测的敏感性。
3.CMV PP65白细胞抗原血症的检测步骤：
取肝素抗凝血5ml，采用右旋糖酐沉降法分离白细胞，用PBS将细胞浓度调整至1.5×106/ml，制备白细胞玻片，固定细胞，细胞打孔，用免疫荧光染色标记PP65阳性细胞。
4.读片和结果判断：
PP65阳性细胞呈均匀的绿色/黄绿色，圆形/多叶的核染色。如果二张玻片结果有予盾，备份玻片。
四、CMV感染的分类和定义(Transplantation,1998,66:1780-86)：
1.CMV活动性感染的定义：血中出现CMV PP65阳性白细胞，即出现CMV抗原血症，包括无症状感染和CMV病。
2.CMV病的定义：
CMV PP65抗原血症出现7天内若体温≥37.8℃持续3天以上者并有下列二项时可诊断CMV病：
(1)白细胞计数≤3.0×10 9/L，无其他原因可解释者；(2)肝炎(血清ALT水平超过正常上限的1.5倍)；(3)不典型淋巴细胞增多，异淋＞10%；(4)间质性肺炎(胸片证实，而无其他原因者)。(5)移植物功能异常。
3.CMV无症状感染者：仅CMV PP65抗原血症阳性，而无临床症状者。
结 果
1.采用ELISA法检测10名健康对照者CMV特异性IgG抗体均阳性，IgM抗体均阴性。CMV PP65抗原血症检测均阴性。36例骨髓移植或外周血干细胞移植者于移植前测CMV特异性IgG抗体均阳性，但IgM抗体均阴性。
2.CMV PP65抗原血症：
36例患者于移植后CMV PP65抗原血症检测阳性者16例，占44.4%(16/36)，其中异基因骨髓移植或异基因干细胞移植者13例，占36.11%(13/36)；16例抗原血症阳性者中15例发生CMV病，占93.8%(15/16)。
3.CMV活动性感染与其他细菌、真菌感染的关系：
PP65抗原阳性者16例中有13例合并细菌或真菌感染，而20例抗原阴性者中仅3例合并细菌或真菌感染(P＜0.01)。
4.接受全身放疗(TBI)与CMV活动性感染的关系：
接受全身放疗组(TBI)的CNV活动性感染的发病率明显高于未接受组，前者发病率为 ９0.90%(10/11)，后者为12.00%(3/25)，P＜0.01。
5.Pre-emptive抗病毒治疗的疗效和死亡率
6.抗CD3+细胞单克隆抗体(FK506)：
7.CMV活动性感染与移植物抗宿主病(GVHD)的关系：
PP65抗原阳性组16例中有13例发生GVHD(81.25%)，而20例抗原阴性者仅4例发生GVHD(20.00%)，抗原阳性与阴性组GVHD发生率有显著性差异(P＜0.01)。
5.Pre-emptive抗病毒治疗的疗效和死亡率
16例CMV PP65抗原阳性患者中，接受更昔洛韦治疗者14例，12例患者经治疗抗原血症阴转，同时症状消失；2例治疗无效死亡，治疗组死亡率为14.2%。未治人数2例，死亡2例(100%)，治疗组死亡率明显低于未治组
(P＜0.01)。
6.CMV特异性IgM抗体阳转者仅2例，占12.5%(2/16)。
讨 论
1.CMV PP65白细胞抗原血症的检测
CMV 间质性肺炎、GVHD分别是异基因骨髓移植最常见或最严重的并发症。因此早期快速诊断CMV活动性感染对降低死亡率、避免过度免疫抑制和指导抗病毒治疗都有重要意义。传统病毒培养法获得结果晚，对早期诊断帮助不大，而ELISA法检测CMV特异性IgM抗体在免疫抑制病人中的检出率低，本组16例PP65抗原血症阳性的骨髓移植和外周血干细胞移植者中仅2例阳性，阳性率仅12.5%，表明在严重免疫抑制患者可缺乏抗体反应或抗体延迟出现。据文献报道，抗体阳转较PP65抗原出现晚30天，本文亦证实此点.
血中CMV抗原阳性细胞是病毒在细胞内活动性复制的感染细胞。其出现提示CMV活动性感染。CMV抗原血症通常在CMV病发作前出现，且在CMV病发作期间持续存在，治疗后随病毒消失而阴转。CMV抗原血症检测可快速早期CMV活动性感染，并可作为亚临床期(pre-emptive)治疗抗病毒治疗的依据，且可观察抗病毒疗效、监控复发和病毒耐药；这种直接检测病毒蛋白的方法不受机体免疫功能影响，其检出率明显高于血清学方法。免疫荧光标记的单克隆抗体检测CMV的低基质磷蛋白(PP65)，即病毒复制早期蛋白检测的优缺点讨论从略。
2.CMV PP65抗原血症检测在监控骨髓移植后CMV活动性感染中的应用：从略。
3.骨髓及外周血干细胞移植后CMV活动性感染的危险因素：从略。