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| patients-number | amount-of-clones-sequenced | amount-of-clones-with-deletion | number-of-deletion(nt) | mutation-site |
| 645 | 9 | 5(556%) | 20，21，22 | after-369-nt |
| 69 | 3 | 3(100%) | 1，8，20 | after-380-nt |
| 841 | 3 | 0 | ||
| 849 | 8 | 5(62.5%) | 8，9，20 | after-383-nt |
| X16 | 3 | 2(66.7%) | 8，9 | after-386-nt |
| 845 | 3 | 0 | ||
| 30 | 3 | 0 | ||
| 32 | 2 | 2(100%) | 9，21 | after-383-nt |
| 4 | 3 | 2(66.7%) | 9，10 | after-383-nt |
| Total | 37 | 19(51.4%) |
Base pair counting begin from the first ATG of X gene,adenosine as number 1。碱基记数是X基因启始密码子(ATG)之腺嘌呤为记数1，下同
2.3 克隆株氨基酸序列比较
X基因编码序列为随分型的不同，编码序列自145至155aa不等，37个预测氨基酸残基序列中18个(48.6%)克隆编码155aa，2个克隆编码长于155aa，缺失突变为16(43.2%)，除点替换突变外，引起X蛋白长度发生改变的突变可分为3类，一类是内部缺失突变，缺失长度自3aa(849-C3)至7aa(645-C2、32-2)不等，其羧基端结尾与正常形式相同；一类是缺失突变结合移框突变，X蛋白长度自133aa至152aa不等，羧基端多以TRRL或KV结束；另一类是移框突变造成的X蛋白延长(69-3、645-B9)，这2个克隆所编码的蛋白长度可能长于本实验所取得的数值，这是由于亚克隆所获得的DNA片段编码终止于X基因3'端下游30nt处，未能展示可能的下游氨基酸序列。
3讨 论
准种概念是指物种的基因组DNA或RNA的碱基序列在统计学上高度一致，但个体之间又存有差异的一组群体。其产生的原理是由于RNA多聚酶或逆转录酶不具有3'-5'外切酶活性，校对功能缺如，从而产生一群存在不同位点点变异的基因组DNA或RNA。在宿主免疫压力的作用下，或在药物的干预下，准种群经过筛检，遗留下优势种群耐受宿主内环境，并继续变异。1993年有学者分别独立的提出HBV存有准种的假说，近年来有少数研究证实了该学说。我们选择X基因为HBV准种研究的靶区域是因为该区功能尚不明确，同时此段序列含有多个HBV病毒蛋白转录调控序列，在HBV生活史中有重要意义。经PCR扩增靶片段后，TA克隆法将单个患者血清内可以获得的克隆尽可能多的存储在载体中。测序结果发现来自同一患者体内HBV X基因呈现高度的多态性，测序的克隆无完全一致者，但同时又具有较高的同源性，符合准种定义。普通Taq酶的错配率为10-5～10-4，而我们扩增的靶片段长度仅500bp，因此可排除在PCR扩增过程中因错配而导致的突变。这证明了HBV准种在慢性感染者中的存在，也与我们S区准种特点的初步观察相一致。
本研究发现HBV X区的替换突变表现为散在分布，但相对集中于核苷酸序列的103～167nt和330～369ng两个区域，因此导致氨基酸序列的29～51aa和116～131aa两区域发生多个点突变。分析氨基酸序列时发现替换突变中存在3种形式，一种形式是突变具有广泛性，来源于多个患者的多个克隆在某氨基酸位点编码不同的氨基酸残基。以第4位氨基酸残基为例，来源于4个患者的15个克隆编码蛋氨酸(M)，其余22个克隆编码缬氨酸(V)；第47位氨基酸残基，13个克隆编码苏氨酸(T)，其余24个克隆编码丙氨酸(A)。部分患者所测的克隆可同时展现这2种编码形式。另一种形式提示突变可能具有个体特异性，患者841的3个克隆第22位氨基酸残基为丝氨酸(S)，其余患者的34个克隆均编码甘氨酸(G)；患者841的3个克隆第106位氨基酸残基为S，其余患者的34个克隆均编码T。第三种形式为散在的随机替换突变，最为常见。本研究提示：①X区可能存在不同的基因亚型或抗原型别。②HBV进入患者体内可能在个体免疫、药物等干预措施等影响下，病毒基因组发生相对较为特殊的突变，以最大程度的适应宿主环境。我们认为来源于不同宿主的X基因存有一定的差异，这种病毒的宿主特异性是由于宿主内环境不同，导致筛检出的HBV准种株出现较小的差异。
本研究还发现X区的缺失突变是相当常见的现象，我们发现37个克隆中有19例(51.4%)发生缺失突变，其集中于核苷酸序列的369～404nt区，导致123位氨基酸之后的X蛋白羧基端发生缺失，甚至提前终止。缺失估变类型可分为2种：一种为缺失8～10bp，另一种为缺失20～22bp。3例(8.1%)患者表现为内部缺失突变，缺失长度自3aa(1例)至7aa(2例)不等，其羧基端结尾与正常形式相同。另一种缺失突变结合移框突变，X蛋白长度自133aa至152aa不等，羧基端多以TRRL或KV结束。既往的研究表明X蛋白具有3个高度保守区，分别处于1～20、58～84和98～140位氨基酸，其反式激活作用可能与这3个区有关；X蛋白的二级结构含有4个α螺旋/卷曲，4个β片层，有一亮氨酸锌指结构(98～135位氨基酸残基)，该结构是X蛋白反式激活作用的基础结构。人为X蛋白缺失实验研究结果提示羧基端的移框突变或替换突变，可导致反式激活作用消失，尤其以132～145位氨基酸区重要，但也有认为大的缺失突变不影响反式激活作用的报道。我们的研究发现在17个缺失突变及2个延长突变的克隆株均影响了98～140保守区的结构，影响了X蛋白羧基端的完整性，破坏了亮氨酸锌指结构。此外，替换突变也可发生在高度保守区，如患者645克隆B16中133位缬氨酸替换为丙氨酸，发生在X蛋白基本结构区之内。上述突变可能影响X蛋白的反式激活功能，这些突变株对反式激活作用的影响的研究正在进行中。
总之，通过PCR法自患者外周血中扩增出HBV X基因序列，通过序列测定发现慢性患者体内存有多种变异形式，构成HBV准种群；X区存有缺失突变的热点区，该区的变异可能影响了X蛋白的反式激活作用。我们认为应加强针对X基因分型及其生物学意义的研究，应进一步加大X基因的测序工作，以明确突变的个体化现象的意义。