基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)能特异性分解细胞外基质(extracellularmatrix,ECM),对肝组织的胶原沉积和组织结构的改建具有重要作用，基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)直接参与ECM的代谢，其底物主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原。MMPs-1降解胶原蛋白的活性受金属蛋白酶组织抑制因子-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)的调节，TIMP-1可与MMP-1形成复合物而抑制它的胶原降解活性，导致ECM在肝内过度沉积。重症肝炎患者易形成坏死后
肝硬化，我们的研究业已证实重肝患者的肝组织胶原纤维基因和胶原蛋白的表达均显著增加。现在，我们从胶原分解的角度探讨其纤维化发生的机理。
材料和方法
一、标本来源
选用1989～1996年重症肝炎患者肝组织标本20例，其中男14例，女6例，平均年龄39岁。HBV感染12例，HCV感染7例，HBV、HCV混合感染1例。其中急性重症肝炎2例，亚急性重症肝炎3例，慢性重症肝炎15例。
临床及病理学诊断根据2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议修订的病毒性肝炎防治方案。另选用6例腹部
手术时取得的非肝炎患者肝组织对照，男5例，女1例，平均年龄42岁。肝组织均常规10%福尔马林固定，石蜡包埋。
二、检测
(一)原位杂交
MMP-1和TIMP-1原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司，编号MK1178和MK1548，均为地高辛标记的寡核苷酸探针，有三个片段。MMP-1寡核苷酸探针序列为：(1)5'-CTTGT GTTTC ATGAG TCGCT GGGAA GCTGT-3'；(2)5'-CCTGA ACAGC CCATG ACTTA TTCCC TTTGA-3'；(3)5'-TCCTG CAGTT GAACC AGCTA TTAGC TTTCT-3'。TIMP-1寡核苷酸探针序列为：(1)5'-ACAGC AACAA CAGGA TGCCA GAAGC CAGGG-3'；(2)5'-TCTCC ATGGC TGGGG TGTAG ACGAA CCGGA-3'；(3)5'-ACAAG CAATG AGTGC CACTC TGCAG TTTGC-3'。
操作步骤按说明书进行。MMP-1：石蜡切片厚6μm，常规脱蜡至水，3%的过氧化氢室温处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶，3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶消化5分钟，0.5M PBS洗涤3次×5分钟，每张切片加20μl的预杂交液，恒温箱37～40℃预杂交2小时，不洗，直接进行下一步。每张切片加20μl含地高辛探针的原位杂交液进行杂交，盖上盖玻片，恒温37℃过夜。杂交后揭掉盖玻片，2×SSC洗涤5分钟×3次和0.2×SSC洗涤5分钟×3次。滴加封闭液，室温20分钟，不洗。滴加抗地高辛抗体，37℃60分钟。0.5M PBS洗涤2分钟×3次，滴加生物素化抗IgG抗体，37℃30分钟后用0.5M PBS洗涤2分钟×3次。滴加SABC，37℃30分钟，0.5M PBS洗涤2分钟×3次。DAB显色。复染、脱水、透明、封片，镜检，并照相记录。TIMP-1原
位杂交检测：先不进行预杂交，而是直接进行杂交，杂交洗涤后每张切片加杂交稳定液A1μl和杂交稳定液B19μl，余操作基本相同。结果用北航医学图象分析系统行图象分析，放大倍数200×，每切片取5个观察视野，取其均值，得出积分光密度。
阴性对照：杂交液不加探针，余操作同上。
阳性对照：试剂公司配有阳性对照片各1张。
(二)免疫组化
鼠抗Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白抗体，生物素标记羊抗IgG及二氨基联苯胺(DAB)等免疫组化试剂购北京中山公司。
Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白的免疫组化检测，按说明书步骤操作。肝组织石蜡切片，脱蜡至水，3%过氧化氢处理5分钟，消除内源性过氧化氢酶的活性，蒸馏水冲洗3次，PBS浸泡5分钟，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热，使容器内液体温度保持在92℃～98℃并持续10～15分钟，进行抗原修复。自然冷却后加山羊血清室温孵育10分钟，倾去血清，不洗，加入1∶100稀释的一抗，湿盒内4℃过夜。PBS洗涤5分钟×3次，滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，37℃孵育10～15分钟。PBS冲洗，3分钟×3次，加DAB显色。苏木素复杂，封片，镜检，照相记录。
阴性对照：省略一抗和二抗，分别用兔血清和磷酸盐缓冲液代替一抗。阳性对照：试剂公司提供阳性对照片各1张。
(三)苦味酸天狼红胶原染色
开狼红0.1g加入100ml饱和苦味酸溶液中配成染液。古蜡切片厚10μm，放入0.1%天狼红中浸染1小时，流水冲洗。脱水封片。镜检，照相记录。
结果用北航医学图象分析系统行图象分析，放大倍数200×，每切片取5个观察视野，取其均值，得出各型胶原面积占总面积的比值。
(四)统计学处理
用SPSS80软件作统计学处理。
结 果
一、MMP-1mRNA的表达(表1)
表1 正常和重症肝炎患者肝组织MMP-1、TIMP-1 mRNA的表达(ILD)
组别 例数 MMP-1 mRNA TIMP-1 mRNA
正常对照组 6 19.58±8.40 4.62±1.45
重症肝炎组 20 28.34±6.61
b 25.38±7.14
a
a:与正常对照相比，P＜0.01；b:与正常对照相比，0.01＜P＜0.05
由表1可见：与正常对照相比，重肝患者肝组织MMP-1 mRNA表达显著增加。表达部位定位在肝星状细胞、再生的肝细胞及胆管上皮细胞的胞浆。
二、TIMP-1 mRNA的表达
由表1可见：与正常对照相比，重肝患者肝组织TIMP-1 mRNA表达显著增加，表达的细胞类型与MMP-1相似。有趣的是在浸润的炎性细胞中也有TIMP-1的表达。
三、肝脏胶原蛋白的沉积(表2)
表2 正常和重症肝炎患者肝组织胶原蛋白含量(胶原面积/总面积)
组别 例数 Total collagen Ⅰ Ⅳ
正常对照组 6 4.06±0.87 1.97±0.83 0.62±0.28
重症肝炎组 20 22.34±4.9９
★ 7.65±1.91
★ 5.03±1.63
★
注：★与正常对照相比，P＜0.01
由表2可见：重症肝炎患者肝组织，无论是总的胶原还是Ⅰ、Ⅳ型胶原含量均较正常对照显著增加。从图6、7(略)可看出，在再生结节周围有大量Ⅰ型胶原沉积，在纤维间隔，肝窦壁有大量Ⅳ型胶原沉积。
四、重症肝炎患者肝组织总胶原含量，Ⅰ、Ⅳ型胶原含量的变化与MMP-1 mRNA、TIMP-1 mRNA表达的关系。
重症肝炎患者肝组织总胶原含量，Ⅰ、Ⅳ型胶原含量与MMP-1 mRNA的表达无明显相关性，与TIMP-1 mRNA的表达呈显著正相关，其相关系数分别为：γ=0.889(P＜0.01)，γ=0.682(P＜0.01)，γ=0.622(P＜0.01)。
讨 论 正常情况下胶原蛋白的合成和分解处于动态平衡，分解代谢的酶主要是金属蛋白酶，在病理情况下，合成增加或分解减少，则可导致纤维蛋白的沉积。MMP-1 mRNA主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，TIMP-1可与活性的MMP-1以1∶1的分子比例非共价结合，与尚未激活的酶原则以紧密结合在一起的复合物形式存在，抑制其对ECM的降解活性。有关重症肝炎患者肝组织MMP-1和TIMP-1 mRNA表达的情况尚未见报道。我们的实验结果显示，重症肝炎患者肝脏MMP-1 mRNA表达较正常对照者显著增加，可能与重症肝炎时，内毒素增加，有关炎性因子如IL-1、TNF-α的增加有关，这些因子均能刺激MMP-1的表达。虽然MMP-1 mRNA表达明显增加，但是它的变化与肝胶原蛋白的沉积无明显的相关性，可能是：(1)MMP-1转录、合成、分泌是一系列复杂的过程，分泌后还要被裂解修饰，形成酶原形式，该过程受许多因素的影响，最后形成有活性的酶的数量并非与基因的表达呈正比。Lichtinghagen R在研究时就发现肝硬化患者的肝组织虽然某些金属蛋白酶的基因表达增加，但酶原的数量减少。(2)酶原的激活受许多因素的调节，其中非特异性抑制因子α-2巨球蛋白和特异性抑制因子TIMP-1起重要作用，即便酶原有所增加，由于抑制因子的作用，最终形成有活性的酶并不增加，所以，MMP-1 mRNA表达虽明显增加，而胶原的降解并没有相应增加，甚或下降。
研究结果显示，TIMP-1 mRNA显著增加。而TIMP-1是MMP-1、MMP-9时特异性抑制因子，业已证实TIMP-1与肝脏炎症和肝纤维化密切相关，我们的研究证明，重症肝炎肝脏胶原蛋白的沉积与增加的TIMP-1对MMP活性的抑制有关。
正常肝组织MMP-1、TIMP-1表达的细胞主要是Ito细胞、成纤维细胞、窦内皮细胞和血管内皮细胞，肝细胞和胆管细胞较少表达。但在重症肝炎患者的肝组织，再生的肝细胞和胆管细胞大量表达MMP-1、TIMP-1，其机理不清。Lichtinghagen发现在周围血的单核细胞和多核白细胞中有TIMP-1的表达，而我们在重症肝炎肝组织炎性区域浸润的炎性细胞中发现有大量的TIMP-1表达，它可能参与炎性区域随后发生的纤维化，确切机理有待进一步研究。
作者：
石淑仙张… 2009-2-21