拉米夫定是新一代核苷类似物，对乙型肝炎病毒具有显著的抑制作用，可迅速降低慢性乙型肝炎病人血清HBVDNA水平，改善肝脏的组织学。但拉米夫定的长期应用，常因HBV P基因的YMDD基序发生变异而对其产生耐药性。治疗1年的耐药率为17%～46%，治疗3～4年的耐药率可达67%～75%。目前对拉米夫定相关的HBV变异的检测方法有多种，各有其局限性，尚未有作者报告用基因芯片技术检测HBV变异。为了验证基因芯片检测拉米夫定相关性HBV变异的敏感性和特异性，我们采用拉米夫定耐药位点基因芯片，对30例慢性乙型肝炎病人的血清标本进行了变异检测，现将结果报告如下。
材料与方法
一、血清标本
血清标本来自于30例慢性乙型肝炎病人，其中20例长期口服拉米夫定，另外10例服用一般性保肝、降酶药物。留取治疗前及以后每次随访的血清标本，-70℃保存备用。
二、拉米夫定耐药位点基因芯片
拉米夫定耐药位点基因芯片由上海博华基因芯片技术有限公司提供。基因芯片制作的简要步骤是：人工合成针对拉米夫定相关性HBV变异位点的特异性寡核苷酸探针，然后将探针基因、定位基因和阳性对照基因进行特殊处理，再用GMS417 Arrayer点样仪把这些基因固定于经特殊处理的硅质玻片上，经水合、紫外交联等后处理后，置-4℃保存备用。芯片矩阵以及耐药毒株位点、野生株位点的分布见图1略。图中每4行为一个矩阵，用于检测一个相应的变异位点。上海博华基因芯片技术有限公司提供拉米夫定耐药位点基因芯片共有4个矩阵，故可同时检测4种拉米夫定相关性HBV变异位点。左边的3列为变异位点检测区，右边的2列为定位基因区。
三、HBV P基因区部分序列的PCR扩增及鉴定
1引物设计：根据HBV P基因的保守区序列，自行设计一对引物。扩增的核苷酸片段，覆盖B区和C区，把拉米夫定相关性HBV最常见的变异位点(YMDD基序的552位和上游的528位)包括在内。引物序列如下：上游引物：5'-GTA TGT TGC CCG TTT GTC CTC-3'(nt461～481)；下游引物5'-CCT TGA CAT ACT TTC CAA TCA ATA-3'(nt997～974)。引物由申友公司合成。
2血清HBV DNA的提取：分别取治疗后12个月、21个月的血清标本100ul，加入300ul TES(含10mM Tris-Hcl；10mM EDTA，0.1%SDS；200ug/ml蛋白酶K)65℃冰浴3小时，酚/氯仿抽提，取上清，加入1/10体积5M的NaAC(PH52)，用2倍无水乙醇沉淀，-20℃过夜，12000rpm离心10分钟，弃上清，自然晾干，加入20ul三蒸水溶解。
3PCR扩增与鉴定：PCR的反应体积为50ul，反应条件是94℃预变性3分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 45秒，循环35次；最后72℃ 7分钟。取PCR产物5ul进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物进行初步鉴定。
四、HBV DNA的序列测定
拉米夫定治疗12个月和21个月时HBV DNA为阳性的病例，其阳性的PCR产物经透析纯化后，直接在全身动测序仪上进行测序，将所得序列与基因库中的HBV参照序列进行比较。同时对部分对照组HBV DNA阳性的PCR扩增产物进行测序。
五、用基因芯片检测拉米夫定相关性HBV变异
1标本处理：经测序证实的有HBV YMDD变异和无HBV YMDD变异的血清标本各10份用于基因芯片检测。取200ul的试剂A于离心管中，加100ul的待检血清，充分震荡混匀，加入试剂B 150ul混匀至无颗粒状，再加入200ul的试剂C，充分混匀。13000rpm离心5分钟后，吸取上清液(约200ul)入另一新的离心管中，加入等体积异丙醇，1/10体积的NaAc(PH5.2)，混匀后置冷冻离心机中，13000rpm离心15分钟，倒去上清，加入600ul 75%的无水乙醇，13000rpm离心10分钟，倒去乙醇后晾干备用。
2PCR标记：通过Cy5标记的dCTP，对PCR引物进行标记，扩增含拉米夫定相关性HBV变异位点的核苷酸片段(包括552、528、548 3个位点)。这样对整个PCR产物进行了标记。主要步骤是，取出PCR反应混合物，离心数秒，取23ul加入PCR反应管中，加入Taq酶03ul，UNG酶03ul，然后加入20ul已处理的标本(用20ul水溶解)，离心数秒，即可放在PCR仪上循环。循环条件是，预处理37℃ 10分钟，预变性94℃ 分钟；随后94℃ 30秒、55℃ 20秒、72℃ 20秒，进行40个循环，72℃延伸5分钟。
3杂交
取9ul的PCR产物加入1.5ml的离心管中，再加入9ul的杂交液，混匀后置95℃变性5分钟，立即放在冰上，取出18ul滴加在芯片的点样区，盖上盖玻片，放入杂交沧，量50℃杂交箱杂交30分钟。
4洗脱
取两染色缸，分别盛有洗脱液1，洗脱液2，放入45℃的水浴锅，将杂交完的芯片置洗脱液1洗脱15分钟。取出放入洗脱液2洗脱10分钟，取出芯片，自然晾干。
5扫描
将芯片置Scanarray4000中，在特定区域上扫描，根据结果判断耐药性。
6重复性试验：对检测阳性和阴性的标本进行50次重复试验，以验证基因芯片检测拉米夫定相关性HBV变异的重复性和可靠性。
结 果
1HBV P基因的扩增及产物鉴定：在拉米夫定治疗12个月的血清标本中，有2例PCR扩增阳性；在治疗21个月的血清标本中，有8例PCR扩增阳性。经琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见539bp的核苷酸片段，与预期的片段一致。对照组8例病例12个月、21个月的血清经PCR扩增呈阳性，改用拉米夫定的2例呈阴性反应。所有病例筛选时(治疗前)血清HBV DNA均为阳性。电泳鉴定结果见图2略。
2HBV P基因的序列分析：对20份标本进行了测序分析，其中，拉米夫定治疗12个月和21个月时，HBV DNA为阳性的PCR产物有10份，另10份为对照组HBV DNA阳性的PCR扩增产物。测序结果表明，治疗组10份标本均HBV YMDD基序和(或)上游528位基因变异，HBV变异情况见表1。另10份对照组标本未发现HBV YMDD变异。
表1 HBV变异类型
| 病人编号 |
变异类型(12个月) |
变异类型(21个月) |
| 201 |
- |
YIDD |
| 203 |
- |
YIDD |
| 208 |
- |
YIDD |
| 219 |
- |
YIDD+L528M |
| 222 |
L528M |
YVDD+L528M |
| 225 |
L528M+YVDD |
L528M+YVDD |
| 237 |
- |
YVDD+L528M |
| 240 |
- |
YIDD |
3基因芯片检测结果：对已进行测序分析的20份标本，用基因芯片对变异位点进行检测，结果显示，基因芯片的检测结果与测序分析结果完全一致。对有些标本，还可识别2种毒株混合感染。其中2例基因芯片检测结果见图3略。重复性试验结果表明，重复率在96%以上。
讨 论
目前，用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎已收到明显疗效，但长期应用时可因HBV YMDD基序出现变异而对拉米夫定产生耐药。因此，临床上急需一种简便、高效的方法检测拉米夫定相关性HBV变异，对用药后的HBV基因变异情况进行动态的监测，以便及时停用拉米夫定或更换其它治疗方案。
现有的检测方法有多种，包括PCR-RELP、基因测序、线性探针检测、Lightcycler技术等，但各有其局限性。已有的研究资料表明，拉米夫定诱导的HBV变异位点多达25处以上，采用PCR-RELP法同时对这么多的位点突变进行检测，在理论上是可行的，但在实际操作中，因工作量巨大，操作繁琐，是难以开展的。此方法多用于552位和528位单点变异的检测。而测序方法虽可发现多位点的变异，但操作复杂，需要数个工作日，极易发生测序失误，多数只能检测一种优势毒株，对多种毒株的混合感染通常不能识别。并且，所需要的仪器设备较为昂贵，是一般医疗、科研单位所不能承受的。
基因芯片技术是近年来发展的一种高通量、平行的基因分析技术，经过设计合理的基因矩阵，可以一次性检测多个位点的突变，并可分辨出突变位点上硷基的替换情况。对已进行测序分析的20份标本，用基因芯片对变异位点进行检测，结果显示，基因芯片的检测结果与测序分析结果完全一致，特异性和敏感性达100%。对有些标本，还可识别2种毒株混合感染。如果每次检测10份标本，整个操作所需时间仅为4个小时，实验操作相对简便，稳定性高，所需设备都是较为常用的普通实验仪器。另外，基因芯片检测成本低，相对于基因测序，基因芯片技术的低成本将是一个优势。并且芯片技术灵敏度极高，检测的样品的只需10ng，而基因测序所需的样品的浓度至少为100ng，在HBV滴度相对低的血清即使经过PCR扩增，也很难达到这个要求，往往导致测序失败。
本研究还发现，基因芯片检测HBV变异具有较好的重复性，能获得96%以上的重复率。较好的决定了基因芯片检测的可靠性。
尽管在现有文献报道中，HBV相关变异位点很多，但多数同时伴随着YMDD区的变异，而其它位点变异在耐药中的重要性及意义，尚待进一步证实，因此，我们采用的芯片暂时选用了4个常见位点，基本能检测目前报道的常见耐药株。以后可根据临床需求和新的有重要意义变异位点的发现，增加新的检测位点，这在技术上已不存在问题。
总之，我们在国内外率先采用针对拉米夫定常见耐药位点的基因芯片，检测拉米夫定相关性HBV变异，并获得了较好的诊断效果及良好的重复性，是一种很有发展前途检测方法
作者：
张继明尹… 2009-2-21