操作时差对酶免疫竞争法检测乙型肝炎病毒核心抗体结果的影响

　　一、材料和方法

　　1.试剂：抗-HBc试剂盒，由上海科华公司提供(批号970812、970717)。

　　2.实验方法1：按试剂盒说明书加入1∶30稀释标本100 μl，分别置室温和37℃水浴0、5、10、15、20、30分钟加入酶标试剂，其后严格按说明书操作。

　　3.实验方法2：先加入酶标试剂，置37℃不同时间后，再加入1∶30稀释标本，其后严格按说明书操作。

　　二、结果和讨论

　　随机检测44份乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗体(抗-HBc)均阴性的血标本，按实验方法1操作，置37℃水浴，并置室温不同时间，另取40份抗-HBc阳性按实验方法2操作(表1)。

表1　加样后放置不同时间(min)对血清抗-HBc酶免疫竞争法测定结果的影响［A(阳性例数)］

　　1.实验操作时差现象、概念及其存在的普遍性。日常标本的检测常是成批的，有时多达几百个。因此加入第一个标本到加入最后一个标本，常需几十分钟甚至数小时，另外加入试剂及混匀等亦同样存在着前后的时间差异。我们将这种因实验操作所需时间而导致加入标本、试剂及混匀时间的差异，称为操作时差。操作时差在每个试验中都存在，其对结果的影响，长期以来未引起重视。从理论上分析，对结果都有或多或少的影响，尤其手工操作，如酶促反应、竞争法等对结果的影响较大，应引起重视。

　　2.操作时差对酶免疫竞争法检测抗-HBc的影响。由表1可见，加样后置37℃5分钟，44例阴性标本即有6例出现阳性结果(χ²检验，P＜0.05)，差异有显著意义。44例不同时间的吸光度(A)值，经t检验即刻加酶标抗体组与各组及各组之间的P均＜0.01，差异有非常显著意义。虽然加样后置室温5、10分钟，与即刻加入酶标抗体的阳性数经χ²检验差异无显著意义，但将各组之间不同时间的A值做t检验，P均＜0.01，差异均有非常显著意义，并出现不同程度的阳性，使临床和病人不能接受。先加入酶标的不同时间40例抗-HBc阳性标本出现不同程度的假阴性，放置10分钟的与即刻加入的经χ²检验，差异有非常显著意义，各组之间的A值经t检验，P均＜0.01，不能为临床所接受。

　　3.试剂鉴定与实际工作的不同性。目前市场上所提供的试剂盒都经过鉴定，即为合格产品。但其鉴定实验多数为单个产品单项试验，基本上不受操作时差的影响。而在实际中一般都有几十个样品，操作时差常达半小时以上。一些复查样本如果编号为前几号，由于异步反应时间较长常会出现阳性结果；如果将这些复查样本编到最后几号，常出现阴性结果，即产生时阴时阳的变化。对此结果较难作出解释，造成临床、病人和检验工作者的矛盾。

　　4.目前酶免疫竞争法检测抗-HBc是“不公平的竞争”。现有酶免疫法抗-HBc试剂盒，为直接用HBcAg包被，或者用抗-HBc包被后再加入HBcAg，用户直接加入标本，再加抗-HBc酶标。这就导致标本的抗-HBc优先结合HBcAg，使样本抗-HBc与酶标抗-HBc产生不公平的竞争。要改变不受操作时差的影响，我们认为必须改进抗-HBc的检测方法。应先用抗-HBc包被，经洗涤后，加稀释样本、酶标抗体混匀，再加HBcAg，再次混匀。这样操作可使包被抗-HBc、样本抗-HBc、酶标抗-HBc三者均衡地竞争HBcAg，即可避免实验操作时差的影响。

　　5.对生产厂商、试剂鉴定审批部门和检验工作者的一点建议。目前，市场竞争十分激烈。厂家为迎合检验工作者，操作步骤越来越简单，反应时间越来越短，而忽视了操作时差对结果的影响。这一问题必须引起重视。为此建议厂商要对试剂盒稀释倍数、操作方法等进行研究，生产特异性强、不受操作时差影响的试剂盒。试剂鉴定审批部门应考虑实际工作中标本的成批性，增加操作时差对结果影响程度的实验。工作中不要盲目选用操作简单、反应时间短的试剂盒，要对自己的检验结果负责，选用不受操作时差影响、结果可靠的试剂盒。