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Recombinant antigen for detecting anti-SSA autoantibody
DENG Anmei, ZHONG Renqian, CHEN Sunxiao, et al.
Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003, China
【Abstract】Objective To detect the level of anti-SSA-60 000 autoantibody in patients with autoimmune diseases as well as its assay methods.Methods We cloned Ro-60 000/SSA cDNA and expressed the SSA-60 000-GST fusion proteins in E.coli JM109. Purified recombinant antigens were used in immunoblotting test (IBT) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were developed. 20 SS sera, 60 SLE sera, 30 normal control sera were tested.Results The recombinant antigen improved the sensitivity for detecting anti-SSA-60 000 autoantibody. Longitudinal studies of several patients with SLE showed that the titres of anti-SSA-60 000 autoantibody were related to the course of disease.Conclusion Recombinant autoantigen is useful for analysis of auotantibody to diagnose and control diseases.
【Key words】Autoimmune diseases;Autoantibodies;Recombinant proteins; Enzyme-linked immunosorbent assay
在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等自身免疫性疾病中，干燥综合征A抗原(SSA)是重要的自身抗原［1］。在约70％～80％的SS患者和30%～40％的SLE患者存在抗SSA抗体。SSA抗原多肽包括60 000和52 000两种分子量不同的成分。传统上用于检测抗体的SSA抗原从动物组织中提取，制备较复杂，且来源不同，成分有所差异。因此，我们尝试用重组抗原检测抗SSA-60 000自身抗体(抗SSA-60 000)，建立敏感性和特异性良好的检测方法，以利于疾病的早期诊断和病程监控。
材料和方法
一、材料
1.人肝λgt11 cDNA文库（R.W.Davis博士赠送）；PGEX-2T质粒，JM109菌株(Z R Lian博士赠送)
2.标准抗SSA-60 000阳性血清由美国疾病控制中心提供。患者血清来自本院1994年8月至1997年8月收治的住院患者，其中SLE 60例、SS 20例。所有患者均符合美国风湿病学会制定的诊断标准［2，3］。30份正常对照血清取自献血者。常规检查采用德国的间接免疫荧光试剂盒及国内IBT检测试剂盒。
二、方法
1.SSA-60 000抗原的基因克隆与序列测定：以标准抗SSA-60 000血清为免疫探针，采用噬斑原位印迹法，筛选人肝λgt11 cDNA文库，挑取表达SSA-60 000融合蛋白的阳性克隆。通过DNA测序鉴定SSA-60 000 cDNA［4］。
2.构建表达型SSA-60 000重组菌：经PCR扩增，将SSA-60 000 cDNA经BamHI和EcoRI双酶切后定向插入PGEX-2T质粒，经CaCl2法转导入宿主菌JM109，再经双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。
3.SSA-60 000重组融合蛋白的表达，鉴定与纯化：挑取重组克隆于37℃振摇培养， 加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导2小时。收集菌液，经谷胱苷肽亲合层析柱纯化，收集洗脱液，进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，经免疫印迹法(IBT)分析重组融合蛋白的抗原特异性。
4.重组融合抗原ELISA法测自身抗体：重组融合抗原用包被碳酸氢钠缓冲液(pH9.5)调节至4 mg/L，加入微量滴孔中，4℃过夜(16 h)。而后依序加入被检血清、辣根过氧化物酶羊抗人IgG、显色剂3，3-二氨基联苯胺和H2O2，经酶比色仪450 nm比色。设相应的血清稀释液抗原抗体反应产物在450 nm产生的1个吸光度A数字为抗体1个单位（U）。
5.统计学处理：用Student′s t检验分析均值差异。
结果
1.重组质粒的鉴定：重组质粒经EcoRⅠ和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳显示，在约为1.6 kb处可见清晰的特异性扩增条带，证实质粒载体中含有以正确方向插入、符合预期长度的目的基因(图1)。DNA测序表明它是SSA-60 000基因的精确拷贝。
1：DNA标准；2：SSA抗原PGEX-2T重组子经EcoRI和BamHI双酶切后；3：载体PGEX-2T质粒；4：分子量为60 000的干燥综合征A抗原PCR产物
1 干燥综合征A抗原(SSA)PGEX-2T重组质粒PCR电泳图
2.SSA-60 000重组GST融合蛋白的表达、纯化：经IPTG诱导表达的大肠埃希菌菌液经10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，在约84 000处有一浓染蛋白条带，而未经IPTG诱导的菌体蛋白在此处呈阴性。经谷胱苷肽层析柱纯化细菌培养液后，获得纯化的融合蛋白(图2)。
1：标准蛋白质；2：含空载体PGEX-2T质粒的JM109菌裂解液；3：含重组子SSA PGEX-2T的JM109菌裂解液；4：纯化的SSA-GST融合蛋白
2 重组融合蛋白电泳图
3.用重组融合抗原检测抗血清：经不同标准抗血清IBT反应证明，重组抗原能与标准抗SSA血清反应，与其他抗血清(如抗La抗体)无交叉反应。可能由于选取抗原来源以及制备过程的差异，我们常规检测所用的IBT检测试剂盒几乎检测不出抗SSA抗体。而用重组融合抗原经IBT和ELISA法却能弥补此不足。用重组融合抗原SSA经IBT检测，30份献血员的血清均为阴性。而在SLE患者中有26例(43.3%)抗体阳性，SS患者中有2例(10%)抗体阳性。在ELISA法检测时，正常对照组值为100 U±50 U，因此以大于350 U(
在ELISA法检测中，分别加入标准抗SSA-52 000、抗SSB、抗平滑肌抗体、抗U1 核糖核蛋白血清，反应均为阴性，表明此重组抗原ELISA法检测抗SSA-60 000抗体具有特异性。我们将同一份血清标本检测10次，所得结果的变异系数(CV)值为0.068；将同一份血清标本分装冻存在3个月内检测10次，所得结果的CV值为10.6%，表明本研究建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。
4.抗SSA-60 000抗体与疾病的关系：在SLE、SS患者中，抗SSA抗体的类型分布有所不同，抗SSA-60 000抗体在SLE阳性率为33.3%，SS为5%；而抗SSA-52 000抗体在SS阳性率为60%，SLE为20%。
我们对4例SLE患者经雷公藤和泼尼松治疗(雷公藤3片，3次/d；强的松10 mg，3次/d)3周前后的抗体进行了ELISA检测。结果显示，治疗后症状缓解的患者中抗SSA抗体滴度下降，而无缓解的患者中抗体滴度无明显改变。
表1 SLE患者治疗前后ELISA检测抗SSA-60 000变化(U)
| 病例 | 治疗前 | 治疗后 | t值 | P值 |
| 1 |
998 |
521 |
3.896 | ＜0.05 |
| 2 | 1080 | 542 | 4.021 | ＜0.05 |
| 3 | 1246 | 604 | 3.964 | ＜0.05 |
| 4 | 2498 | 2312 | 1.476 | ＞0.05 |
讨论 我们采用标准抗SSA-60 000血清筛选人肝λgt11噬菌体cDNA文库，分离表达相应抗原的克隆，对所得克隆的DNA序列进行了测定；将自身抗原目的基因克隆到表达载体上，利用工程菌表达自身抗原，经纯化后建立敏感性和特异性良好的检测方法，用于检测抗SSA抗体，以利于疾病的早期诊断和病程监控。
本研究中含重组质粒的大肠埃希菌JM109经IPTG诱导，其裂解液经SDS－PAGE电泳在近84 000处出现大量蛋白表达，不含目的基因的大肠埃希菌JM109在相应的位置未见浓蛋白条带，而含空载体PGEX-2T质粒的大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后也出现大量蛋白表达，但位置在26 000处，这与载体表达的谷胱甘肽-S-转移酶有关。根据氨基酸组成推算，SSA-60 000重组蛋白的分子量为57 500，再加上载体PGEX-2T质粒本身可表达的原核多肽谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为26 000，融合蛋白分子量预计在83 500左右，我们的结果与之相符。经IBT和ELISA证实，本研究获得的重组蛋白可用于检测自身抗体。
研究表明，抗SSA的抗体在自身免疫病临床表现中有重要意义［5］。在SS中，抗SSA抗体与脉管炎、紫癜、淋巴结病、白细胞减少和高γ球蛋白血症等临床症状呈正相关。我们对4例SLE患者经雷公藤和泼尼松治疗前后的抗体进行了ELISA检测，结果显示，治疗后症状缓解的患者中抗体滴度下降，而无缓解的患者中抗体滴度无明显改变，表明抗SSA-60 000抗体活性与临床病情呈正相关。我们以前对于自身免疫病患者中，可抽提核抗原条带与体液免疫激活状态的研究发现，自身免疫病患者中，可抽提核抗原条带越多，体液免疫激活程度越高，IgG水平越高［6］。而现在利用重组抗原检测的结果与之相一致。
目前IBT法检测SSA-60 000敏感性不足，采用重组抗原可弥补这一缺陷， ELISA法具有定量的作用，所以可对患者病程进行监测， 但其准确界限对提高敏感性而又不降低特异性很重要，需我们在以后的工作中摸索确定。
基金项目：上海市启明星基金资助项目(94QB14002)
参考文献
1 Reichlin M. Autoantibodies to the RoRNP particles. Clin Exp Immunol, 1995, 99:7-9.
2 Fox RI, Saito I. Criteria for diagnosis of sjogren′s syndrome. Rheum Dis Clin North Am, 1994,20:391-407.
3 Tan EM. 1982 Revised criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982,25:1271-1273.
4 邓安梅，仲人前，孔宪涛.自身抗原Ro-60 000 cDNA克隆及表达.第二军医大学学报，1998,19：20-22.
5 邓安梅，仲人前，孔宪涛.SSA抗原研究进展及临床应用.中国免疫学杂志，1997，13：92-94.
6 Deng AM, Zhong RQ, Kong XT. Anti-ENA profile and humoral immune activation. J Milit Med Univers, 1999,20:38-44.