酶联免疫吸附试验检测HCVNS3-4A蛋白酶活性

摘　要　目的　建立一种检测丙型肝炎病毒(HCV)NS3-4A丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，用于筛选HCV蛋白酶抑制剂。方法　将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K₁₂TB₁中，经IPTG诱导表达，亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的NS3/NS3-4A融合蛋白，用Western blot分析其免疫学活性，并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果　SDS-PAGE电泳分析并用考马斯亮蓝染色，显示相对分子质量112 000和116 000处有麦芽糖结合的NS3及NS3-4A融合蛋白带出现；Western blot分析表明，表达的产物可与抗NS3蛋白的单克隆抗体发生阳性反应。ELISA证实HCV NS3-4A蛋白酶能使特异底物裂解。正交实验获得ELISA的最佳实验条件，其P/N值为3.63，批内和批间变异系数(CV)分别为4.16%和7.52%。此方法测定1，4萘醌对HCV蛋白酶活性50%抑制浓度(IC₅₀)为8.36 μmol/L。结论　建立的ELISA方法，用于测定HCV蛋白酶活性，具有简便、快速、重复性好等特点，为以HCV NS3-4A蛋白酶为靶酶的抑制剂筛选及抗HCV药物的研究奠定了基础。

　　关键词：丙型肝炎病毒　酶联免疫吸附试验　NS3/NS3-4A融合蛋白酶

　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是导致丙型肝炎的病原体，目前治疗丙型肝炎费用昂贵，停药后复发率高。因此寻找抗HCV的新药已成为人们关注的热门课题。然而，至今HCV的细胞培养尚在研究中，且仅人和黑猩猩易感，故目前尚缺乏理想的研究或筛选抗HCV药物的体内外模型。HCV NS3蛋白酶可裂解HCV多聚蛋白的非结构蛋白区NS3-4A,NS4A-4B,NS4B-5A和NS5A-5B连接^［1］。近年来，HCV NS3蛋白酶已作为抗HCV药物作用的靶酶，其相关蛋白NS4A，是NS3蛋白酶活性的辅助因子，NS4A可提高NS3蛋白酶活性^［2］。Sudo等^［3］以HPLC方法测定HCV蛋白酶活性，用于药物筛选，但样品需要较高纯度。为大量筛选抗HCV药物，笔者建立了HCV NS3-NS4A蛋白酶的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。

　　材料和方法

　　材料　质粒pMAL-c2/NS3-4A为本室制备。鼠抗NS3蛋白的单克隆抗体由中国预防医学科学院病毒所詹美云教授惠赠，辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体购自Promega公司。地高辛标记-N-羟基琥珀酯(Dig-NHS)，碱性磷酸酶标记的抗Dig-NHS抗体为Boehringer mannheim公司产品。合成肽：Ac-GEA/GDD/IVP/CSM/SYT/WTK-Biotin-OH.由赛百盛公司合成。其余均为国产分析纯试剂。药物：1，4萘醌为本院校药物所王琳教授惠赠。

　　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析　按文献［4］的方法进行。

　　HCV NS3-4A融合蛋白的制备　将重组质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K₁₂TB₁中，阳性菌落加入含100 μg/ml氨苄青霉素的1升LB培养液中，于37 ℃培养，当A570 nm=0.4时加1 mmol/L IPTG诱导4 h收获菌体，加裂解液(每升含20 ml 1.0 mol/L Tris.Cl,pH7.4,11.7 g NaCl,2.0 ml 0.5 mol/L EDTA,154 mg二硫苏糖醇(DTT)，0.1%Triton-X 100,1 mg溶菌酶)，超声波破碎，亲和层析，用含10 mmol/L麦芽糖的柱缓冲液(终浓度∶20 mmol/L Tris-HCl,200 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT)洗出融合蛋白，用Bradford蛋白实验检测蛋白含量。

　　建立测定酶活性的ELISA方法　将100 μg/ml麦芽糖结合融合蛋白MBP-NS3-4A溶于缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5 mmol/L CaCl₂，10 mmol/L DTT,30 mmol/L NaCl)中，与二甲基亚砜(DMSO)25 ℃预先孵育15 min,然后加入终浓度为86 μmol/L的底物，60 min后，加3倍体积DMSO终止反应。取2 μl上述反应液加入5 μl 100 mmol/L碘乙酸钠在微孔板中于37 ℃保温30～60 min，以阻断自由的半胱氨酸，然后加入50 μl DMSO溶解的2 mg/ml Dig-NHS于37 ℃保温30～60 min。加入阻断剂，室温放置60 min，加碱性磷酸酶标记的1∶1000抗Dig-NHS抗体，室温放置60 min。加对硝基苯磷酸显色15 min，测A405 nm。同时设置不加MBP-NS3-4A蛋白酶的阴性对照。以实验孔A值/阴性孔A值(P/N值)作为测定结果。

　　1，4萘醌对HCV蛋白酶活性的抑制作用　用DMSO将1，4萘醌分别配成为1、0.1、0.01和0.001 mmol/L，每个浓度两孔，与HCV NS3-4A蛋白酶25 ℃预先孵育15 min,其余步骤与测定酶活性方法相同。同时设立阴性，阳性及药物对照孔。

　　结　　果

　　HCV NS3及NS3-4A融合蛋白的诱导表达及免疫学鉴定　含重组质粒pMAL-c2/NS3或pMAL-c2/NS3-4A的菌液经IPTG诱导后，超声破碎细胞，离心，取上清两份，一份作SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后显示，IPTG诱导后在相对分子质量(Mr)为112 000和116 000处有NS3及NS3-4A蛋白带出现(附图A)。另一份经亲和层析纯化后，作Western blot免疫印迹鉴定，目的蛋白带与抗NS3蛋白的单克隆抗体发生阳性反应(附图B)。

　　HCV NS3-4A融合蛋白酶活性ELISA测定的最佳条件　蛋白酶浓度为2.5、0.5、0.1 mg/ml，Dig-NHS浓度为2、0.8、0.32 mg/ml，抗Dig抗体浓度为1∶250、1∶500、1∶1000，按L₉(3⁴)正交表进行ELISA试验。结果显示，当蛋白酶反应温度为37 ℃时，最佳试验条件为：0.5 mg/ml蛋白酶，2 mg/ml Dig-NHS，1∶500抗Dig抗体，其P/N值为3.50。当蛋白酶反应温度为25 ℃时，最佳试验条件为：0.1 mg/ml蛋白酶，2 mg/ml Dig-NHS，1∶1000抗Dig抗体，其P/N值为3.63。

　　ELISA测定方法的重复性评价　采用蛋白酶反应温度为25 ℃时的最佳条件进行重复性试验，同批试验中重复10次，平均P/N值为3.652，批内变异系数为4.16%；不同的10批重复试验，平均P/N值为3.632，批间变异系数为7.52%。

　　1，4萘醌对HCV蛋白酶活性的抑制作用　随1，4萘醌浓度增高(0.001、0.01、0.1和1 mmol/L)，对蛋白酶的抑制作用也随之增大，抑制率分别为18.60%、64.20%、72.48%、90.80%，其对蛋白酶活性抑制率达50%时的药物浓度(IC₅₀)为8.36 μmol/L。

附图　HCVNS3/NS3-4A基因在大肠杆菌中的表达及Western blot检测

　　fig　　HCVNS3/NS3-4A expression in E.coli and Western blot analysis

　　a.SDS-PAGE　Lane M:protein markers;Lane 1,2,3,4:uninduced samples containing pMAL-C2/NS3,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2;Lane 1^’,2^’,3^’,4’:IPTG-induced samples containing pMAL-C2/NS3,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2

　　b.Western immuno-blot　1.MBP-NS3;2.MBP-NS3-4A

　　讨　　论

　　HCV丝氨酸蛋白酶NS3是丙型肝炎病毒繁殖必不可少的复制酶，因此它可作为抗HCV药物靶点。NS4A可提高NS3裂解活性，虽然裂解NS5A-5B连接NS4A不是必需的，但Sudo等^［3］试验发现合成多肽底物时，NS3-4A裂解活性比单独用NS3活性更强。

　　Sudo等^［3］曾报道用HPLC方法检测HCV蛋白酶裂解底物活性，并以此方法筛选抑制剂，但此方法要求抑制剂的纯度高，且不利于大量筛选。Takeshita等^［5］用ELISA与HPLC方法作比较，抑制剂对酶活性抑制效果类似，说明ELISA方法同样可用于抑制剂的筛选。本研究参考国外相关资料，建立了HCV蛋白酶的ELISA测定法。实验证实1，4-萘醌显著抑制HCV蛋白酶活性，与国外报道一致^［5］。当严格控制试验条件，操作规范时，该方法不仅简便、快速，而且稳定、重复性好，批内变异系数小于5%，批间变异系数小于10%，因此适用于同时筛选大量样品，并可成为寻找抗HCV新药非常有效的体外实验模型。

　　国家自然科学青年基金（39700180）资助

　　陈湘红(中国医学科学院　中国协和医科大学　医药生物技术研究所病毒室，北京100050)

　　郭巨涛(中国医学科学院　中国协和医科大学　医药生物技术研究所病毒室，北京100050)

　　陈鸿珊(中国医学科学院　中国协和医科大学　医药生物技术研究所病毒室，北京100050)

　　王琳(中国医学科学院　中国协和医科大学　医药生物技术研究所病毒室，北京100050)

　　参考文献

　　［1］Bartenschlager R,Ahlborn-Laak,Mous J,et al.Kinetic and structural analyses of hepatitis C virus polyprotein processing.J Virol,1994,68:5045-5055

　　［2］Steinkuler C,Urbani A,Tomei L,et al.Activity of purified hepatitis C virus protease NS3 on peptide substrates.J Virol,1996,70:6694-6700

　　［3］Sudo K,Inoue H,Shimizu Y,et al.Establishmemt of an in vitro assay system for screening hepatitis C virus protease inhibitors using high performance liquid chromatography.Antiviral Res,1996,32:9-18

　　［4］Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T著.金冬雁,黎孟峰等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社,1992.255-262,880-898

　　［5］Takeshita N,Kakiuchi N,Kanazawa T,et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for detecting proteolytic activity of hepatitis C virus protease.Anal Biochem,1997,247:242-246