点击显示 收起
本研究旨在通过免疫组织化学ABC法测定人肝细胞癌(HCC)及其癌旁肝组织和正常肝组织中金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)的表达情况，探讨其在国人HCC中表达的生物学及临床意义。
一、材料与方法
1.HCC组织和癌旁肝组织 湖南医科大学附属湘雅医院普外科和湖南省肿瘤医院外科1997年12月～1999年1月手术切除的HCC标本35例。全部病理切片重新检查均证实为HCC。所有病例术前均未接受其他治疗。其中男33例，女2例，年龄31～71岁，平均49岁。按Edmonson病理分级：Ⅰ级5例、Ⅱ级16例、Ⅲ～Ⅳ级共14例。全部病例乙肝表面抗原均呈阳性。癌旁肝组织为光镜下上述35例HCC组织周围的非癌肝组织，均有不同程度的肝病背景。正常肝组织5例，取自1988年1月～1999年1月切除之肝血管瘤周围正常肝组织，其中男3例，女2例，年龄34～55岁，平均44岁。
2.免疫组织化学的检测方法及主要步骤：标本离体后，经10%甲醛固定。石蜡包埋，制成5 μm厚切片2张，1张HE染色；另1张用于免疫组化，采用ABC法，其操作步骤简述如下：切片脱蜡入水，用体积分数为3% H2O2处理以灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，滴加小鼠抗人MTs单克隆抗体(一抗，克隆号E9，购自武汉博士德生物工程有限公司)，工作浓度1∶50，4℃下过夜；滴加生物素化山羊抗小鼠lgG(二抗)，滴加试剂SABC，DAB显色，苏木素衬染；脱水，透明，封片。以PBS置换一抗，其余步骤同上作为阴性对照。
3.免疫组化结果判断标准：以棕黄色作为阳性标准。光镜下：A.按细胞显色有无及深浅记分。0：无色，1：浅色，2：深色；B.按显色细胞所占比例记分。1：1/3以下；2：1/3～2/3；3：2/3以上。MTs积分=A×B。按积分高低分为：“-”阴性：0分；“+”弱阳性：1～2分；“”强阳性：3～6分。
4.统计学方法：Ridit检验。
二、结果
阴性对照无MTs阳性着色，表明我们在本实验中所用小鼠抗人MTs单克隆抗体(E9)的特异性。MTs阳性表达主要均匀分布于胞浆，少量位于胞核。5例正常肝组织MTs表达均呈强阳性(100.0%)，而血管瘤组织、胆管以及纤维组织MTs染色则呈阴性。在35例HCC中，有29例MTs表达阳性，阳性率为82.9%。其中强阳性6例(17.1%)、弱阳性23例(65.7%)、阴性6例(17.1%)。35例癌旁肝组织MTs染色亦均呈强阳性(100.0%)。统计学结果显示，HCC中MTs表达较其相应癌旁肝组织和正常肝组织低，差异有显著性(P＜0.01)。但癌旁肝组织和正常肝组织之间，MTs表达差异无显著性(P＞0.05)。此外，本研究结果还显示HCCⅠ级MTs表达阳性率达100.0%，高于Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级，后二者阳性率分别为81.0%和78.0%，可能由于样本数的关系，它们之间的差异无显著性(P＞0.05)。
三、讨论
本实验显示正常肝组织及癌旁肝组织中MTs含量丰富，表达均呈强阳性，而HCC组织中虽有MTs的表达，但含量明显低于正常肝组织及相应癌旁肝组织。MTs在正常肝组织中含量丰富，是肝脏参与金属解毒这一功能的物质基础。肝癌组织分化较差，故包括MTs在内的功能蛋白表达下降。MTs是细胞内一种重要的自由基清除剂，而哺乳动物细胞内基因突变最重要的原因是内源性氧化损伤。MTs表达的下降将导致细胞内氧化物的堆积，从而引起某些原癌基因的激活或抑癌基因的失活而引发肝细胞癌变［1］。
Kelley等［2］1988年发现对顺铂耐药的肿瘤细胞系MTs呈过度表达，并且尚显示对诸如氮芥、卡铂等亲电性化疗药物的交叉耐药性，但其对长春新碱、氟脲嘧啶、博莱霉素、阿霉素等非亲电性化疗药物依然敏感。故MTs在肿瘤细胞中的表达是临床上肿瘤对亲电性化疗药物产生耐药性的原因之一，其机制可能是肿瘤细胞内的MTs可以结合并阻止进入细胞内的亲电性化疗药作用于靶分子而发挥药理效应。本实验结果发现，HCC中MTs的表达呈现明显的异质性，35例HCC中强阳性6例(17.1%)、弱阳性23例(65.7%)、阴性6例(17.1%)。故我们推测，部分HCC对亲电性化疗药物的耐药性可能与HCC中MTs的表达有关。因此，在制定HCC的区域或全身化疗方案时，可考虑根据HCC中的MTs含量来选择敏感化疗药物。
基金项目：湖南省科委重点资助项目(98ssy1008)
参考文献
［1］Rossman TG,Goncharova EI.Spontaneous mutagenesis in mammalian cells is caused mainly by oxidative events and can be blocked by antioxidants and metallothionein.Mutat Res,1998,402:103-110.
［2］Kelley SL,Basu A,Teicher BA,et al.Overexpression of metallothionein confers resistance of anticancer drugs. Science, 1988,241:1813-1815.