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【摘要】 目的 探讨脊髓前角运动神经元是否存在许旺细胞源神经营养蛋白的受体。 方法 采用放射性配体结合分析法，对许旺细胞源神经营养蛋白进行125I标记，以125I标记的许旺细胞源神经营养蛋白（125I-SCDNTP）为配体，与SD胚鼠的脊髓前角运动神经元进行受体结合分析。 结果 （1）125I-SCDNTP特异结合最大结合容量为（6.1±0.48）fmol／106cells，平衡解离常数为（3.82±0.60）pmol／L；（2）动力学分析显示k1＝（8.03±0.32）×108mol－1.L·min－1，k－1＝（2.62±0.82）×10－3min－1；（3）特异性分析表明许旺细胞源神经营养蛋白与运动神经元的结合具有高度特异性。 结论 在SD胚鼠的脊髓前角运动神元上存在着高亲和力许旺细胞源神经营养蛋白的受体。
Radioreceptor assay of Schwann-cell derived neurotrophic protein
LU Xiaolin，ZHU Jiakai， LIU Changzhen，et al.
Department of Microsurgery，First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To identify the presence of schwann cell derived neurotrophic protein（SCDNTP）receptor in motoneurons.Methods SCDNTP was labeled with 125I using chloramine-T method and isolated by sephadex G75 column chromatography.The receptor assay between 125I-SCDNTPand embryonic rat spinal motoneurons was carried out with 125I-SCDNTP as a radioligand.Results The right condititon of binding was incubation at 25℃，PH 7.4，for 20 min in 1.2×105 cells/ tube.Scatchard plotting shown that there was a high-affinity binding.Equilibrium dissociation constant（Kd）and maximal binding capacity（Bmax）were（3.82±0.60）pmol／L and（6.1±0.48）fmol／106 cells respectvely.The kinetics of 125I-SCDNTP binding were characterized by the association rate constant［k1＝（8.03±0.32）×108 mol－1.L·min－1］and dissociation rate constant［k－1＝（2.62±0.82）×10－3 min－1］.Specificity studies revealed this binding were highly specific.Conclusion These results demonstrate the presence of SCDNTP receptor in embryonic rat spinal motoneurons.
【Key words】 Schwann cells Neurotrophic factors Receptor
许旺细胞源神经营养蛋白（Schwann-cell derived neurotrophic protein，SCDNTP）是从许旺细胞中提取的一种神经营养蛋白，分子量为54kD，尤其对运动神经元有较强的营养支持和促进其损伤后修复作用［1］。但SCDNTP的作用机制尚不清楚。国内外报道的一些神经营养蛋白是通过激活相应的受体起作用［2］。SCDNTP是否也有受体存在须持证实。本实验用125I标记SCDNTP，采用放射配体结合分析来研究运动神经元是否存在SCDNTP受体。
材料与方法
一、主要试剂与仪器
SCDNTP本实验室自制。Na125I，无载体，8.71GBq／ml，中国原子能科学研究院同位素研究所制品。2.5sNGF、bFGF、BDNF、NT-3为Cigma产品，氯胺T，分析纯。Tris-磷酸缓冲液，0.05mol／L，PH7.4。Sephadex-G75，Pharmacia公司产品。Sephadex G75凝胶柱(柱长15cm，直径1cm）。XH-6010γ放射免疫计数器。
二、运动神经元分离与纯化
14～15天胚龄SD大鼠16只，取脊髓腹侧半，按Victoria法［3］酶消化、密度梯度离心分离运动神经元，用胆碱乙酰基转移酶单克隆抗体免疫组化鉴定运动神经元并进行细胞计数。
三、125I-SCDNTP制备
采用氯胺T氧化法：取Na125I 1.85×107Bq／10μl，加SCDNTP 20μg／10μl，氯胺T20μg／250 μl冰水浴下搅拌1分钟，加偏重亚硫酸钠100μg／250μl，1％碘化钾100 μl终止反应。立即将反应混合物上Sephadex G75凝胶柱层析（15×1cm）分离结合和未结合的125I，用Tris-磷酸缓冲液淋洗，流速1ml／min，以每管0.5 ml分布收集淋洗流出液并测量其放射性，收集第一放射峰并分装，于－20℃贮存。根据淋洗曲线计算标记率和比活度(直接法)，用纸层析法测定标记物的放化纯度。
四、放射性配基结合分析
(一)温度和时间对配体-细胞结合的影响
Eppendorf管中加运动神经元悬液100μl（1.2×105cells），125I-SCDNTP50μl（3×104计数／分钟)，非特异结合管中另加入SCDNTP50μl（54nmol／L）。分别于4℃、25℃、37℃条件下反应5、10、20、30、40、60、90分钟（pH均为7.4），每管加4℃的缓冲液稀释混匀，4℃、4 000r／min离心10分钟，吸去上清液，测沉淀的放射性。计算特异性结合，根据其与时间和温度的关系，从中筛选最佳的反应温度和时间。