应用成人自体干细胞对于缺血、梗塞心肌组织的重建治疗--理论的设想与临床实现的距离心脏外科学 | 39康复网

中国人民解放军总医院王禹盖鲁粤        刚刚过去的2004年，是应用成人自体干细胞（Autologous Stem Cell）对于缺血、梗塞心肌组织重建治疗、具有重要意义的一年。7月的Lancet杂志发表了德国汉诺威大学Wollert KC等的BOOST研究结果（并在2004年11月美国AHA大会上报告）。10月19日，在第44卷JACC上全文发表了德国法兰克复歌德大学完成的、第1个随访时间到12个月的TOPCARE-AMI临床研究结果。BOOST试验是第1个采用随机、空白对照的成人自体骨髓干细胞（Bone-Marrow Stem Cell, BMSC）对于急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction, AMI)后心肌功能影响的研究。而TOPCARE-AMI是随机的、应用成人自体外周血干细胞(Circulating Progenitor Cell, CPC )和骨髓干细胞，干预AMI的临床试验研究，也是迄今为止随访研究时间最长（12个月）的临床研究。两个重要的临床研究均得出初步结论：应用骨髓干细胞和/或外周血干细胞，在AMI后，通过冠状动脉直接注射，对于恢复明显受损的左室功能，具有积极的作用（LVEF平均提高5-8%），其时间至少持续到注射后的12个月。并且有很好的安全性：未见出现包括恶性室性心律失常在内的明显的副作用、未出现原梗塞相关血管支架内的明显内膜增生、未见全身炎性反应增强等。
     长期以来，研究者都认为：像人体的许多其他组织一样，心肌组织、细胞是不能再生的、是分化终末的组织细胞；同时近期也有研究提示：当人体组织系统受到严重创伤后，会激发体内组织的“自身修复过程”，心肌组织细胞也是如此，但是以往的诸多的研究显示：心肌组织细胞的自身增殖修复能力相对于体内其他脏器组织是非常低的（比如肝脏组织）；通常心肌组织细胞在受到严重损伤后，主要是以心肌细胞的肥厚（负荷过重）、或局限性肥厚伴纤维化（心肌梗塞坏死）的形式修复。但是这种观点在近年受到明显地质疑。Beltrami AP等的研究显示：在成人的心肌组织细胞中仍然存在有细胞的有丝分裂（mitosis），他们的研究显示在死于严重心力衰竭病人心肌组织中，细胞的有丝分裂水平（mitotic figures）是正常情况下的10-60倍（尽管总体仍处于低水平）。Laflamme MA等的研究显示，心肌组织外的干细胞移植入人心脏组织中，能够使得心肌细胞再生长（Regeneration）。
     2001年Nature杂志发表了Orlic等的（Genetics and Molecular Biology Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland，USA） “经典”的研究，该实验研究表明：应用免疫荧光技术发现：在小鼠受损的心肌组织中大量的移植骨髓造血干细胞，可以显著分化为心肌的肌细胞。随后又有许多基础研究学者、心脏病学家，通过经冠状动脉注射、心脏搭桥手术时直接注射到损伤心肌周围、或通过激光途径经心外膜注射干细胞等技术手段，将干细胞导入缺血、梗塞的心肌组织中，总的结果显示，干预后的心脏功能似乎都有了一些改善。
     但是在2004年Murry CE、Balsam LB等在Nature上发表的几个重要研究，均对于骨髓干细胞或外周血干细胞导入缺血的心肌组织内，是否能够分化为真正的心肌细胞，提出质疑。他们应用基因工程技术而不是免疫荧光技术的研究结果显示：在小鼠的实验性心肌梗塞模型中，外源性的骨髓干细胞只有很小一部分能够分化为心肌细胞，而绝大部分细胞则继续它们的造血干细胞系（haemopoietic lineage）分化进程。Wagers AJ等对于这些机械直接导入的细胞能否良好地由造血干细胞系转化为心肌局部组织的肌细胞系，也提出异议。综合目前的基础研究结果趋向于：各种干细胞( 包括BMSC和CPC)进入缺血心肌组织局部，促进缺血心肌组织的修复，可能的主要机制有：细胞的融合（fusion）、促进局部新生微血管的生成、新生心肌细胞的生成以及促进局部细胞因子的旁分泌（paracrine）作用等，这些作用可能综合改善缺血、梗塞心肌组织的功能。
     值得注意的是：我们在应用各种途径导入干细胞、关注心肌组织细胞的再生时，应同时注意冠状动脉的变化。2004年Lancet上发表的、随机设计的MAGIC临床试验结果显示：应用粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factors, G-CSF）预处理后的外周血干细胞，直接注射入冠状动脉，可以导致明显差别于对照组的、原靶血管支架内的再狭窄。提示：这种刺激因素，在作用于局部心肌组织时，也会明显地作用于支架内新生内膜的生长。还是在2004年，Vulliet PR等的研究显示：在狗的动物模型中，直接经冠状动脉注射间质基质细胞（Mesenchymal stromal cell），会导致动物出现明显的冠状动脉的微栓塞-微梗塞形成。
     同时近期Menache P，Herreor J，Smits PC等的另外一些重要研究显示，在缺血、梗塞心肌组织局部导入（或通过搭桥手术时直接注射或经皮途径）骨骼肌成肌细胞（Skeletal Myoblasts）后，心肌局部的功能有一定的恢复，但同时发现，该组病人严重心律失常的发生比例明显增加，因此这种技术途径也受到严重地质疑。
     早在2002年，Circulation杂志就发表了德国多塞尔多夫大学Strauer等的第1篇经导管、经冠状动脉直接注射骨髓干细胞干预AMI后心室功能的非随机观察性研究。初步结果是令人鼓舞的。从目前技术发展的趋势分析，经皮、经导管（Tans-Catheter）地导入干细胞的技术途径，可能是今后治疗技术的主要发展途径。
     综合分析这几个重要的临床研究，可发现目前心肌缺血/梗塞后干细胞治疗的临床研究，仍存在有以下一些重要问题：
     1 多数研究不是严格随机、双盲的。Strauer等研究是观察性的（20个入选病人，10例入选骨髓干细胞治疗组病人是自愿的、而另外10例病人因拒绝参加试验，则被选做对照组）；TOPCARE-AMI研究虽然是随机的，但两组病人实际上均是治疗组（骨髓干细胞或外周血干细胞），而没有随机分出的空白对照组，基本是病例的自身前后对照，因此其说明问题的能力是有限的。而仔细分析BOOST研究会发现：该研究实际上是首先依据特定的入选标准（低LVEF病人），选择了60个病人（而不是在某一时间段入选的连续的AMI病例），然后再将这选择好的60个病人随机分到BMC治疗组和对照组，因此，并不是真正意义的随机。
     2 病例的观察、随访时间短：Strauer等的研究随访3个月，BOOST为6个月，只有TOPCARE-AMI随访至12个月；但是仍然不能回答：即使这种治疗方法有效，是否能“一次注射就终生受益”？还是需要多长间隔再次治疗？
     3 具体技术问题：细胞导入途径、何种或几种细胞最有效（BOOST只注射CD34+细胞，而Strauer和TOPCARE-AMI注射的为CD34+和AC133+混合细胞）、何时是导入的最佳时机、注射多少细胞量最为有效而且安全？
     4 理论上特别是临床实践上，仍然无法直接标记/检测到是否有新的心肌细胞的再生，仍然只有观察心脏功能改善的间接指标（但的确是个重要的指标）；
     5 样本数量过少：研究病例数最多的BOOST试验，也只有60例病人，其发现治疗组与对照组之间的差异，只有70%左右的统计学把握度。
     6 几个试验选择病例的特征：仔细分析BOOST和TOPCARE-AMI研究的数据，可以发现：两个试验入选病例的基础左室功能均很差：TOPCARE-AMI入选病例的左室造影LVEF只有40～42±7.7-11.0%；而BOOST则明确要求入选病例要有2/3的心肌区域是无或低运动状态，Baseline的LVEF 为46～47±3-8%；Strauer等的研究的Baseline-LVEF为：49±7%。这反映几个试验入选的这些病人，实际上是AMI中，梗塞范围相对大、基础心功能较差的病人亚组。这种特征病例的选择，究竟有何种系统性偏倚（Systemic Bias）、对于实际治疗中（Real world）的价值和意义如何，仍有待于进一步研究。
     任何的新理论、新技术、新方法的出现和应用都是在基础研究和临床实践同时开展的情况下，才能得以最快速度地发展和完善的（而不是等到基础研究已经完全清楚后才进行临床试验）。国内也已经开展血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell, EPC）对于缺血心肌和外周组织的实验治疗，取得初步正性结果。目前这些缺血心肌组织干细胞治疗所存在的问题和真正的临床远期效果，还有待于今后更大研究样本的、随访时间更长的、严格随机的、双盲的、甚至需要通过“伪装的”的临床试验（Masked clinic trial），才能够予以真正解决和证实。同时也需要更加深入的基础研究，以揭示细胞水平的主要机制。

作者： 2007-7-10