北京朝阳医院 王乐丰 张大鹏
近来心脏细胞治疗（Cardiac Cell Therapy，CCT）技术迅速发展起来，这一方法包括将细胞移植至梗死区心肌、增加或保持心肌数量、改善血管供血以及提高缺血心肌的收缩功能。其中骨髓干细胞移植治疗心肌梗死及心梗后心衰成为研究的热点之一。细胞心肌移植中骨髓干细胞改善心肌损伤后的心功能与其两大特点有关：①肌源性特点：即再心肌化，具有心肌的可塑性，能向心肌细胞分化与宿主心肌细胞形成缝隙连接可能产生同步收缩补充的肌源性细胞，具有弹性，稳定梗死区域防止室壁变薄、室腔扩大和心衰发生。②血管源性特点：即再血管化，能向内皮细胞分化，参与移植后血管生成并能分泌血管内皮生长因子加速血管生成过程。
现今，干细胞能够分化成新生血管细胞没有异议，但对于它们是否能够分化为心肌细胞存在着激烈的争论。在如何实施干细胞治疗以及该治疗是否有确切的长期疗效等方面亦存在很多问题。尽管早期的非随机对照实验表明移植细胞可以缩小左室梗死面积，如Orlic等曾发表了一项有关(Acute Myocardial Infarction , AMI)进行前干细胞动员的心肌梗死大鼠模型研究，该研究被认为具有里程碑意义，结果显示动物AMI前采用干细胞动员
制剂进行预处理可显著改善预后。令人遗憾的是，其他几个实验室没有重复出Orlic等人的实验结果，自体骨髓干细胞（BMCs）转分化的能力受到了质疑。2006年，德国的Zohlnhofer等对粒细胞集落刺激因子（G-CSF）激活的BMCs治疗AMI进行了随机双盲安慰剂对照研究。在发病12小时内成功接受PCI术的114例患者随机接受BMCs治疗组及安慰剂治疗组，随访4~6个月。与对照组相比，治疗组患者LVEF无明显改善，梗死面积无明显缩小，两组间再狭窄率也无差异。结果认为，在急性心肌梗塞成功机械再灌注的情况下，G-CSF干细胞动员治疗对梗塞面积、左室功能以及冠状动脉再狭窄没有影响。挪威的ASTAMI研究入选100例接受急诊PCI治疗的前壁心肌梗死患者，随机分为病变冠脉内BMCs治疗组和对照组，随访6个月，结果发现两组患者的LVEF组间没有显著性差异。来自丹麦的STEMMI研究也显示随访6个月后两组患者LVEF具有相似水平的增加（8.5%对8.0%），在AMI的急性期BMCs对细胞因子没有动员作用。2006年4月，德国汉诺威医学院Meyer等发表了全球首个骨髓细胞移植促进ST段抬高心梗再生的随机对照
临床试验（BOOST，the BOne marrOw transfer to enhance STelevation infarct regeneration）的长期（18个月）随访结果，在该试验中，AMI后成功接受急诊PCI治疗4.8±1.3天的患者被随机分为冠脉内输注BMC或安慰剂两组（每组30例）。BMC细胞悬液含有（24.6±9.4）×108个有核细胞，（9.5±6.3）×106个CD34细胞和（3.6±3.4）×108个造血集落形成细胞。采用磁共振成像技术来评价左室功能。结果显示，在移植6±1个月后，BMC组和安慰剂组左室射血分数（LVEF）分别升高6.7%和0.7%。左室功能较对照组改善显著。但18个月再评价时，两组左室功能的改善不再存在显著差异，安慰剂组LVEF升高3.1%，BMC组升高5.9%。研究者认为尽管BMC组LVEF的恢复速度更快，但与安慰剂相比，单剂BMC冠脉内输注对AMI患者左室收缩功能的长期改善并不明显。
以上这些研究提示我们需要对心血管病干细胞治疗领域的许多重要问题进行深入思考，主要集中于以下几点：
一、干细胞移植改善梗死后心脏功能的可能机制究竟是什么？ 干细胞移植改善梗死后心脏功能的可能机制包括：①分泌促血管生成因子促进心肌血管网络重建；②分化生成新生的心肌细胞并担负一定舒缩功能；③通过旁分泌途径促进心脏侧支循环的建立和有效的血液灌注；④抑制心肌细胞凋亡。但究竟是哪一种或哪几种机制在起作用，作用程度如何，至今尚未明确。干细胞是否具有横向分化能力是基础和临床研究两个领域中最大的争议，近来干细胞的横向跨系分化行为受到质疑。在有的研究中并未发现干细胞与宿主细胞间形成结构和功能上统一的电－机械复合体，在细胞移植后发生恶性
心律失常，甚至猝死。Weissman等将干细胞植入大鼠心脏后并未发现分化现象，Verfaillie等认为目前所见分化现象是来源于成体组织中残存的胚胎样原始干细胞而非成体干细胞，而Terada则提出所谓骨髓干细胞的分化表现，其实是干细胞与胚胎干细胞融合后产生胚胎样细胞，从而彻底否定了成体干细胞的可塑性理论。Zhang等将人外周血CD34干细胞移植到小鼠心脏后发现细胞融合、分化两种现象并存，提示我们，融合可能是隐藏在某些分化假象下的本质。在目前的临床试验中，干细胞移植后的疗效观察均为短期内随访，罕见有长期随访结果的报道，因此干细胞对心脏修复的远期作用以及机制问题还有待深入探讨。
二、如何选择最合适的细胞类型？
选择合适的细胞类型至关重要，但目前尚无有关不同细胞作用的比较研究。目前，在临床应用中所用的干细胞类型包括自体骨髓单个核细胞、干细胞动员因子、内皮祖细胞和骨骼肌成肌细胞（skeletal myoblast），以及近几年开始应用的骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞。
1.骨髓单个核细胞（BM-MNCs）的分离方法简单，将骨髓经密度梯度分离后即可获得，能够满足AMI患者急症
手术之需，且可进行自体移植无免疫排斥反应，是大多数临床研究中所采用的细胞类型。但是MNCs成分复杂，含有多种类型的细胞，其中造血干细胞是否能横向分化为心肌细胞尚无定论。这样一大群细胞在心脏微环境中的生物学行为能否被控制？这些细胞是只朝着预期的有利方向发展，还是可能产生其他不利后果？等等问题均未可知。Yoon等发现，骨髓干细胞移植入大鼠梗死心脏后，有可能在心脏环境中分化形成骨或软骨等组织，MNCs是否需要预先经定向诱导，去除可能不利的分化潜能以达到理想的治疗效果，尚需进一步深入研究。
2.干细胞动员因子能够刺激骨髓中的干细胞释放入外周血，向损伤组织归巢、迁移，可能参与组织修复过程。但是CD34造血干细胞可分化为心肌细胞的可塑性理论近来备受争议，应用干细胞动员因子治疗缺血性心脏病的理论基础已经动摇。在MAGIC试验中，应用G-CSF患者的冠状动脉再狭窄率增高，这项研究因此提前终止。干细胞动员因子能否用于心血管疾病的治疗有待进一步证明。
3.内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）可以由骨髓的成血管细胞前体细胞、非造血间充质前体细胞以及骨髓／单核细胞系细胞分化而来，这些细胞最后在外周血成为内皮细胞（Endothelial Cells，ECs）。BM-MNCs和外周血单个核细胞（PB-MNCs）中包含有EPCs。由于来源广泛，EPCs的鉴别较困难。尽管目前的临床试验认为EPCs移植安全可行，但许多问题尚未明确。首先，EPCs数量有限，须经培养才能扩增到足够的细胞数，但在培养过程中细胞很可能发生分化、衰老；其次，年老患者和
糖尿病病人的EPCs功能低下，促血管生成的作用减弱，而这些患者在理论上恰恰是EPCs移植最大的受益人；再次，EPCs移植的效果如何尚存在分歧，BOOST研究虽然证明BM-MNCs移植可以显著改善整体LVEF，但是这种改善与CD34细胞数没有相关性。EPCs移植尚未经过随机、对照和双盲试验的验证，对待已有的研究结果不能盲目乐观。
4.骨骼肌成肌细胞（Skeletal Myoblast）虽然可以改善梗死后的心功能，但由于无法与宿主心肌细胞形成连接结构，不能建立有效的兴奋——收缩耦联，因此不被临床看好。
5.骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs）是一类可进行自我复制和更新的细胞，在一定条件下可向骨、软骨、脂肪和心肌等多种细胞谱系分化。但是，MSCs同时具有体积较大，粘附力强的特点，有可能在冠脉内移植时造成血栓形成和血管痉挛等不良后果，不利于临床应用。而且MSCs数量极少，仅占骨髓有核细胞的0.01%，需经体外培养扩增才能获得足够数量进行移植，因此无法适应急诊手术。所以，尽管MSCs具备优异的分化能力，但可否用于临床尚待研究。
6.胚胎干细胞（embryotic stem cells，ESCs）具有全能分化特性，理论上似乎是最佳的细胞类型，但是其活跃的分化行为有可能导致
肿瘤形成，而且由于牵扯伦理问题，因此现阶段还难以被临床采用。
三、如何确定移植的时间窗？
宿主心肌内环境（niche）与干细胞的生存情况密切相关，何时进行细胞移植尚无定论。目前有关移植时间窗的研究较少。如要确定最佳的移植时间窗，必须进行多个时间点移植的比较研究才能得到结论。
四、应该采用何种移植方法？
目前用的方法主要包括直接心外膜注射、心内膜注射、静脉注射、和冠状动脉导管注射四种细胞移植途径。
1.选择性冠状动脉内移植的方法可以在最大程度上使干细胞定植于心脏，能够避免心肌内直接注射引起的心肌损伤，还可以同PCI手术相结合进行，患者无需开胸，因此是目前临床移植中最常用的方法。但是这种方法也有不足。首先，对于体积较大的细胞而言，如MSCs、成肌细胞等，如采用经冠脉移植则可能导致微血栓形成。其次，在移植时，如何保证尽可能多的干细胞穿越血管壁分布到心肌组织中还有待研究。
2.经心外膜移植的方法可以在直视下进行，将细胞注射到心肌梗死的边缘区和/或瘢痕区，定位性较好。但是另一方面，经心外膜移植可能在注射细胞时导致心肌损伤，是一种有创性操作，必须开胸暴露心脏与旁路移植手术相结合进行，限制了其在临床的应用，而且由于不能脱离旁路移植术单独进行，经心外膜干细胞移植的疗效评价也受到影响。
3.经心内膜移植是在心肌电机械描记设备引导下，携带注射针的导管穿过主动脉瓣后进入左室腔，在心内膜表面根据电位确定缺血部位，然后将干细胞以垂直于心内膜的方向注射到心肌内。经冠状静脉移植是在带有血管内超声导引的导管辅助下，由冠状静脉将干细胞注射入心肌内的新方法。经心内膜移植和经冠状静脉移植均属于非外科治疗方法，创伤小，但是都需要配备特殊导引装置，而且要求定位精确，在许多病例中不能适用。
4.经静脉移植是一种类似“全身给药”的方法，由于治疗的靶向性差，干细胞不能有效定植在缺血心肌部位，因此无法参与修复过程，临床应用价值较小。如果直接将细胞注入右室腔则会形成大面积肺动脉栓塞而导致动物立即死亡。
五、如何在体示踪植入的干细胞？
在体示踪植入人体的干细胞，能够获得有关细胞归巢、分布、定植等重要信息，有利于尽早阐明干细胞移植改善心脏功能的机制问题。首先必须选择合适的细胞标记物。理想的标记物应该满足以下标准：①生物相容性好，安全无毒；②不会引起细胞基因改变；③可以在任何解剖部位检测到单个细胞；④可以准确定量细胞数目；⑤随着细胞分裂，标记物不会或极少被稀释；⑤所用造影剂不会被干细胞吸收；⑦可以满足长期随访要求，对人体无损害；⑧对造影剂无要求，等等。但是目前在临床可用的影像技术均不符合这些标准。如CT技术用于活体示踪细胞时只能使用大量的高密度造影剂，如固体金属、钆、碘等，目前难以实现。生物发光和荧光标记技术已经在动物实验中运用，却无法适用在临床。利用超声学造影技术可以检测到与单个造影剂微泡结合的单个细胞，但是这种方法尚未成熟，是否影响细胞运动也未明确，而且微泡产生的“阴影”将干扰准确判断细胞数目。SPECT和PET技术也可用于干细胞的在体示踪，但是所使用的放射性标记物可能引起细胞的基因突变。MRI是目前最常用的干细胞示踪技术，但是如果病人带有埋藏式自动除颤复律器、起搏器等治疗装置会严重影响MRI的图像采集。
六、应采用何种方法评价疗效？
由于受到方法学限制，在临床研究中不能随意进行心脏组织学检测，干细胞在人心脏内的分化、增殖情况还不得而知，所以细胞移植的疗效只能采取检查心功能和/或心肌灌注的方法。在目前各项研究中所采用的评价方法各不相同，缺乏统一的衡量标准，难以对实验结果进行比较。
七、细胞移植后将会有何副作用？ 尽管BOOST试验已经初步证明干细胞移植可安全用于临床，但在细胞移植潜在的副作用，应当引起足够的重视：
1.G-CSF治疗最常见的副作用是骨痛和肌肉不适。
2.心律失常是临床关注最多的不良后果。如果植入的干细胞没有与心肌细胞间建立有效的电-机械连接结构，则不能进行同步舒缩运动，因而有可能产生异位兴奋点，导致心律失常发生，甚至是恶性心律失常。
3.有研究已经发现在干细胞移植后，心脏出现钙沉积。
4.尽管当前临床研究中尚无致肿瘤形成的报道，但是否确实不会发生，仍需密切关注。
综上所述，在干细胞治疗心血管疾病方面我们有很多问题尚未解决，心梗急性期干细胞治疗疗效及其对患者的长远影响尚无定论。我们在探索干细胞治疗心血管疾病的征途上应该谨慎，而不该过分激进。
作者：
2007-7-10