干细胞移植治疗缺血性心脏病 黎 健 卫生部北京老年医学研究所
心肌梗塞的治疗
可供移植的细胞
可在体外培养并能保持未分化的增殖能力
具有分化为多种类型细胞的潜能
无致癌性
不引起宿主的免疫反应
符合伦理道德
移植干细胞
梗死的心肌
未知的分子信号
细胞迁移到损伤区域
增殖和分化
细胞质蛋白
肌球蛋白
a-肌动蛋白
间隙连接蛋白 43
细胞核蛋白
Csx / Nkx2.5
MEF2
GATA-4
心肌功能性恢复
干细胞移植途径
开胸后经心外膜心肌注射
应用NOGA系统经心内膜心肌注射
经导管系统梗死相关血管内注射
冠状静脉窦内注射
外周静脉注射
成体干细胞移植
骨骼肌成肌细胞的移植
骨骼肌成肌细胞有效整合到受损心肌部位
改善了左心室的功能:
移植1个月后射血分数增加( > 30%)
室腔扩张减少
梗塞面积减少
移植的效果
骨骼肌成肌细胞心肌内注射2个月后
骨骼肌细胞重链蛋白的表达
Skeletal MHC
fast form
Rat a-MHC
embryonal MHC
Skeletal MHC
fast form
左心室射血分数 (EF)比较
超声心动图
PET-心肌显像
Systolic shortening:
undetectable LV-EF= 30%
Fluoro-deoxyglucose uptake
Posterior wall=injection site
存在的问题
骨骼肌成肌细胞移植虽然改善了心肌梗死患者左心室功能,然而由于骨骼肌成肌细胞只能分化成骨骼肌细胞而非心肌细胞,在心肌内新生的骨骼肌细胞与宿主心肌细胞之间超微结构不同而无法直接形成电—机械耦联,与宿主心肌细胞收缩舒张不同步,导致心律失常,患者可能需要植入昂贵的心脏自动复律除颤起博器.
成体干细胞移植
骨髓干细胞的移植
成体骨髓干细胞分化图谱
AC133+ bone marrow stem cells are isolated from the bone marrow preparation using the CliniMACSr system (Miltenyi Biotech)
磁珠法分离骨髓单核细胞系统
AC133+ stem cells are isolated by antibody labelling and magnetic bead separation.
骨髓中的单核细胞
Bone marrow cells
Lin-, ckit+
骨髓干细胞治疗心肌梗塞
Orlic, Anversa et al. Nature 410, 701–705 (2001)
骨髓干细胞重建梗塞心肌
Lin-/c-kit+BMSCs. B. Lin-/c-kit- BMSCs
Red: cardiac myosin Green: GFP
间隙连接蛋白43的表达与定位
F, Adult control heart myocytes
G, Newly formed young myocytes
GFP-骨髓干细胞表达心肌特异蛋白TnI
×400
Arrows indicate combined green and red fluorescence, representing cardiomyogenic cells derived from GFP-BMC
骨髓干细胞移植（导管植入）
骨髓干细胞移植促进病人心脏功能恢复
Both patients had had an anterior acute myocardial infarction. Bright colours indicate good systolic wall motion, whereas dark colours indicate poor wall motion (expressed in mm). Note improved functional recovery in the patient treated with bone-marrow-cells.
细胞移植3个月后心肌梗塞前壁功能改善
detected by 201thallium scintigraphy
细胞移植和普通疗法治疗效果的比较
…
NS
NS
P
NS:不显著
NS
64±7
62±10
治疗3个月后左心室射血百分数, %
NS
60±7
57±8
治疗前左心室射血百分数, %
血液动力学数据
…
NS
0.028
P
NS
2.3±1.6
4.0±2.6
治疗3个月后梗塞壁运动速度, cm/s
NS
1.8±1.3
2.0±1.1
治疗前梗塞壁运动速度, cm/s
收缩指数
…
NS
0.005
P
0.04
20±11
12±7
治疗3个月后梗塞区域百分数, %
NS
25±8
30±13
治疗前梗塞区域百分数, %
梗塞区域
…
10
10
病人数
P
普通疗法
细胞移植
移植的GFP阳性细胞主要位于心肌梗塞处
9 d
9 d
28 d
GFP+ cells still expressed CD45 (inset).
×20
×120
×500
×120
×500
促进干细胞迁移到损伤部位的因子
干细胞因子 (SCF) 和c-kit ( 酪氨酸激酶受体).
CXCR4 和基质细胞源性因子 ( SDF-1 ).
粒细胞克隆刺激因子( G-CSF ) 和粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子( GM-CSF ).
血管内皮细胞生长因子 ( VEGF ) / Flk-1.
×400
No c-Kit+ (red)cells are observed in infarcted myocardium (left) unless mobilized by treatment with cytokine: GM-CSF (right). Hoechst nuclear stain is in blue.
GM-CSF动员造血干细胞和前体细胞到心肌梗塞区
GM-CSF诱导植入细胞迁移到梗塞区域
9天
28天
GFP
CD45
×500
A
B
C
D
Engrafted bone marrow–derived cells in infarcted myocardium expressed GFP (A) and CD45 (blue; B), but notα-actinin (red; C). (D) Merger of images in A–C
移植到心梗处的细胞没有表达心肌特异的α-辅肌动蛋白
Expression of α-actinin (red) in surviving endogenous (GFP–) cardiomyocytes but not in bone marrow–derived (GFP+) cells in infarcted myocardium (left) and infarct border zone (right).
×200
GFP阳性细胞移植后没有表达α-辅肌动蛋白
移植的骨髓干细胞与原有心肌细胞发生融合
PBS Group
PBT Group
BMT Group
细胞移植增加了血管的密度
show vessel density as revealed by staining with anti-factor VIII antibody
a
b
Cell implant
Saline
细胞移植促进了新血管的形成
骨髓干细胞移植改善心肌功能的作用机制
少数干细胞分化成心肌细胞,改善心室功能
干细胞与宿主心肌细胞发生细胞融合,直接参与宿主心脏收缩
干细胞移植促进心肌细胞分泌细胞因子如VEGF促进原血管系统的再生成
骨髓干细胞中存在内皮祖细胞,可促进血管再生
骨髓干细胞移植的安全性:
骨髓干细胞植入后引起心肌钙化
胚胎干细胞移植
胚胎干细胞的来源
胚胎干细胞分化的多潜能性
多潜能的胚胎干细胞
细胞/组织的治疗
神经细胞
心肌细胞
骨髓细胞
胰腺细胞
心肌细胞的分化：悬滴法
跳动的胚小体（第八天）
MLC2v 基因启动子
未分化的胚胎干细胞
Untransfected
GFP transfected
流式细胞仪收集带绿色莹光的心肌细胞
胚小体分离的心肌细胞表达心肌结构蛋白MLC2v
= expression of ECFP driven by the MLC2v promoter
心肌梗塞动物模型的建立
心肌梗塞的心脏
胚胎干细胞分化的心肌细胞移植（直接注射）
肌浆球蛋白和 GFP的表达
移植心肌细胞的迁移与间隙连接蛋白43的表达
0
10
20
30
40
50
60
70
80
% Infarct vs. bed at risk
a
b
c
Saline
Cell implant
Saline
Cell implant
P < 0.01
(n=6)
(n=6)
干细胞移植减少心肌梗塞的面积
MRI显示心梗面积的变化
胚胎干细胞移植需要解决的主要问题
● ES细胞定向分化心肌细胞效率低, 难以纯化得到足够数量的心肌细胞
● ES细胞移植后产生免疫排斥反应
● ES细胞来源于囊胚胎, 对其进行研究和应用涉及到伦理学问题
● ES细胞存在致瘤性, 其安全性需进一步研究
谢 谢 大 家!