一 花刺参粘多糖对血管平滑肌细胞粘附分子表达的影响
山东省医学科学院基础所
蔡生业 王利民 张健 姚成芳 王丽 周宪宾 王恒孝
研究目的
观察花刺参粘多糖对TNF-α诱导的大鼠细胞间粘附分子（ICAM）-1、血管细胞粘附分子（VCAM）-1表达的影响。
为临床开发有效的防治动脉粥样硬化、再狭窄药物提供理论基础。
方法与步骤
Wista大鼠
选取5-12代细胞
VSMC原代培养
空白对照组
花刺参粘多糖组
TNF- α刺激组
RT-PCR、流式细胞仪、细胞粘附实验检测处理后VSMC粘附分子的表达情况
大鼠胸主动脉平滑肌细胞的原代培养与鉴定
无菌条件下取4-6周龄Wista大鼠胸主动脉，分离血管中膜平滑肌层，组织贴块法原代培养，
0.25%胰蛋白酶消化传代，实验选用生长稳定的5-12代细胞。
SM-α-actin免疫荧光法鉴定证实
结果判定：阳性细胞呈黄绿色荧光。荧光显微镜下细胞数/同一视野光镜下细胞数×100%=阳性细胞率
细胞分组及用药
取生长良好的5-12代VSMC，用0.25%胰蛋白酶消化，以1×105/ml密度接种于培养瓶或培养板中，培养至80%融合时，换用含0.5%FBS培养液继续培养24h，使VSMC同步化，细胞随机分为5组，各组分别加入下列药物，使TNF-α的终浓度为10ng/ml
空白组：2%FBS
TNF-α刺激组：2%FBS+TNF-α
花刺参粘多糖组：2%FBS+TNF-α +花刺参粘多糖 1.5mg/ml、3mg/ml、6mg/ml组
RT-PCR检测各组细胞粘附分子mRNA表达情况
细胞总RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。
RT
PCR
PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳。
凝胶成相系统分析仪观察并摄片。
结果分析 :待测mRNA的表达量以待测粘附分子与内参照?-actin积分光密度值的比值表示
流式细胞仪检测
将上述分组与用药细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，PBS收集细胞，FITC-ICAM-1 、PE-VCAM-1一抗重悬细胞，冰上避光孵育30min，PBS洗两次，离心弃上清
0.7mlPBS重悬细胞，流式细胞仪检测其平均荧光强度。
单核细胞-平滑肌细胞粘附试验
接种于96孔板生长状态良好的VSMC按上述分组及用药
制备单核细胞悬液
单核细胞与VSMC粘附30min
染色、脱色后于酶标仪570nm读取各孔A值
统计分析
所有实验数据采用SPSS10.0软件做统计学处理，数据以均数±标准差表示。计量资料两组间的比较用t检验，各组间差异用单因素方差分析， P < 0.05表示差异有统计学意义。
实 验 结 果
大鼠血管平滑肌细胞的原代培样及鉴定
×100
×200
组织贴块法原代培养
峰-谷样生长
SM-α-actin 免疫荧光鉴定
阳性 ×100
阴性对照 ×400
阳性 ×400
RT-PCR检测ST对大鼠血管平滑肌细胞粘附分子mRNA表达的影响
ICAM-1（185bp）
?-actin（417bp）
* **
**
与TNF-α刺激组比较
*P<0.05 **P<0.01
RT-PCR检测ST对大鼠血管平滑肌细胞粘附分子mRNA表达的影响
?-actin（417bp）
VCAM-1（561bp）
** **
**
与TNF-α刺激组比较
*P<0.05 **P<0.01
流式细胞仪检测ST对大鼠血管平滑肌细胞ICAM-1表达的影响
同型对照
空白对照组
TNF- α刺激组
ST小剂量组
ST中剂量组
ST大剂量组
流式细胞仪检测ST对大鼠血管平滑肌细胞VCAM-1表达的影响
同型对照
空白对照组
TNF- α刺激组
ST小剂量组
ST中剂量组
ST大剂量组
与TNF-α刺激组比较 *P<0.05 **P<0.01
**
**
**
**
**
**
单核细胞-平滑肌细胞粘附试验
A、空白对照组
B、TNF-α刺激组
C、 ST小剂量组
D、 ST中剂量组
E、 ST大剂量组
A
B
C
E
D
单核细胞-平滑肌细胞粘附试验
*
**
**
与TNF-α刺激组比较 *P<0.05 **P<0.01
结 论
大鼠胸主动脉VSMC正常情况下粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达量很低
TNF- α可明显刺激VSMC表达ICAM-1、VCAM-1两种粘附分子
ST可显著抑制TNF- α刺激的VSMC粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达，可阻止VSMC与单核细胞的粘附，且具有剂量依赖性
ST抑制促炎症因子刺激导致的细胞粘附分子表达上调，可能具有增加粥样斑块稳定性和延缓动脉粥样硬化进程的作用，对减轻血管壁的炎症反应有一定作用， 具有临床开发前景。
二 花刺参粘多糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响
本项研究的目的
明确花刺参粘多糖（ST）及复方ST对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(vascule smooth muscle cell,VSMC） 增殖的影响
明确ST及复方ST对体外培养的大鼠VSMC凋亡的影响
从细胞、分子水平探讨ST及复方ST 制剂防治PTCA后再狭窄的作用机制。
实验方法
传代5-12次，10%FBS静止培养24h，0.5%FBS同步化细胞24h
ST组
他汀组
复方组
模型组
对照组
MTT、流式细胞计数、TUNEL、RT-PCR检测
RASMC的原代培养
方法：组织块贴片法
动物：Wistar 大鼠
步骤：脱颈处死，无菌分离大鼠胸主动脉，PBS冲洗，刮除内皮，剪成1mm3的组织块，将其平铺于培养瓶(竖放或倒放) ，放入37℃、5%CO2培养箱中静止培养。 6h后培养瓶加入含20%FBS的DMEM培养液继续培养。约7～10天，SMC从组织块周围爬出。
VSMC鉴定
方法：细胞免疫荧光
抗体： α-SMA （mouse IgG)
荧光：FITC标记
阳性结果判定：发黄绿色荧光。
实验分组和模型
对照组:含0.5%FBS的DMEM
PDGF模型组:含0.5%FBS的DMEM+PDGF-BB（终浓度达到20ng/ml）
FBS模型组: 0.5%FBS的DMEM+ 10%FBS
复方ST组：模型组加复方ST（大、中、小剂量分别含中药提取物终浓度为60 、30 、10mg/ml）
辛伐他汀组：模型组加辛伐他汀10μmol/L。
ST组：模型组加入ST（20 mg/ml 、5mg/ml）
细胞增殖、细胞周期测定方法
MTT法酶标仪测定细胞增殖率（OD值）变化
流式细胞仪（PI染色）测定细胞G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例变化。
细胞凋亡测定方法
流式细胞仪（ ANNEXIN V / PI双标记）测定细胞凋亡率差异。
TUNEL(脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)原位杂交 测定细胞凋亡。
阳性结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞 。
统计学处理方法
所有实验数据采用SPSS11.0软件做统计学处理，计量资料以均数±标准差表示。计量资料各组间差异用单因素方差分析，用LSD或Tamhane’s T2进行验后两两比较， P < 0.05表示差异有统计学意义。
结 果
VSMC α-SMA 免疫荧光鉴定图（×100）
VSMC增殖率改变
PDGF刺激各组MTT结果
注：与模型组比较 * P < 0.05 ，** P < 0.01.
PDGF刺激各组MTT结果
复方ST各剂量组呈现出剂量依赖性（P < 0.01）。复方ST大、中剂量组、ST大剂量组与辛伐他汀组相比，差异无统计学意义。
FBS刺激各组MTT OD值结果
注：与模型组比较 * P < 0.05 ，** P < 0.01；与辛伐他汀组比较△△ P < 0.01
FBS刺激各组MTT OD值比较
复方ST三组、辛伐他汀组、ST大剂量组抑制了VSMC增殖,与模型组相比差异显著（P < 0.05）；且复方ST各剂量组呈现出剂量依赖性。复方ST大剂量组、ST大剂量组抑制增殖程度大于辛伐他汀组（P < 0.01），复方ST中、小剂量组与他汀组比较无差异。
小 结
复方ST组、辛伐他汀组、ST组抑制了VSMC增殖,与模型组相比差异显著。
复方ST各剂量组呈现出剂量依赖性。
在FBS模型，复方ST大剂量组、ST大剂量组抑制增殖程度大于辛伐他汀组；在PDGF模型，各药物组比较无差异。
二 VSMC细胞周期改变
PDGF刺激各组细胞周期改变
注：与模型组比较 * P < 0.05 ，** P < 0.01
PDGF
MODEL
%G1=87.5
%S=7.1
%G2=5.5
%G1=77.4
%S=14.8
%G2=7.7
%G1=90.3
%S=6.3
%G2=3.4
%G1=87.5
%S=6.7
%G2=5.8
%G1=88.1
%S=6.3
%G2=5.6
复方ST组、ST组和辛伐他汀组G0/G1期细胞比例皆显著高于模型组(P < 0.05)；S期细胞比例有相反的变化。三药物组作用无差异。
FBS刺激各组细胞周期改变
注：与模型组比较 * P < 0.05 ，** P < 0.01
?
复方ST组、ST组和他汀组G0/G1期细胞显著多于模型组 ，S期细胞比例有相反的变化。药物组间作用无意义。
%G1=87.5
%S=7.1
%G2=5.5
对照组
%G1=54.7
%S=32.5
%G2=12.9
模型组
%G1=69.9
%S=19.6
%G2=10.6
复方ST
%G1=71.8
%S=14.1
%G2=14.1
辛伐他汀
%G1=75.8
%S=13.9
%G2=10.4
ST 组
10%FBS
MODEL
小 结
PDGF、FBS刺激后，G0/G1减少，S期细胞增多。
ST、复方ST使G0/G1增多，S期细胞减少
ST、复方ST、辛伐他汀组作用无差别。
三 VSMC细胞凋亡流式结果
PDGF刺激各组细胞凋亡流式结果
注：与模型组比较 * P < 0.05 ，** P < 0.01
与模型组相比，复方ST组、辛伐他汀组、ST组细胞早期凋亡率明显增高(P < 0.05)。复方ST组、ST组早期凋亡率与辛伐他汀组相比皆无统计学差异。
Control=11%
Model =8.6%
Com=26.8%
Sim=27%
ST=22.6%
PDGF刺激各组细胞凋亡流式结果
FBS刺激各组细胞凋亡流式结果
注：与模型组比较 * P < 0.05 ，** P < 0.01；与他汀组比较△△ P <0.01
与模型组相比，复方ST组、辛