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【摘要】目的探讨海藻多糖对人HL-６０细胞增殖的影响。方法采用集落培养、MTT、形态观察等方法，研究海藻多糖对(HL-６０）体外增殖的影响。结果海藻多糖对体外培养的HL-６０细胞的抑制作用随时间和浓度的增加而增强，MTT结果示当浓度为800 μｇ／ｍｌ，作用48 ｈ时抑制率为(51.30±３.１０）％。结论海藻多糖体外可抑制HL-６０细胞增殖，提示其在抗肿瘤方面有一定的开发应用前景。
【关键词】海藻多糖；HL-６０细胞；增殖
The inhibitory effects of the seaweed polysaccharide on the HL-６０ cell
LIN XinmeiWANG GuoxiangLU Xianet al
Departemnt of Pediatrics,Affiliated Hospital of Binzhou Medical College,Binzhou256603
【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of seaweed polyaccharide on the proliferation in the HL-６０ cell line.MethodThe MTT,clone forming approaches and cell morphology were adopted.ResultsSeaweed polyaccharide can inhibit the proliferation of HL-６０ cells in a dose- and time-dependent manner in a certain range of dose (0～８００μｇ／ｍｌ）．After being treated with the polysaccharide (800 μｇ／ｍｌ） for 48 h,the inhibited rate is (51.30±３.１０）％．ＣonslusionThe seaweed polysaccharide can inhibit the HL-６０ cell proliferation,suggesting it can be used as an antileukemia drug.
【Key words】seaweed polysaccharide,HL-60 cell,proliferation
多糖在细胞的生命活动中起着重要作用，它参与了细胞的生长、分化、衰老和死亡过程。我国传统中医常用马尾藻等治疗乳腺癌与子宫癌,国外也开展了使用海藻多糖进行肿瘤防治的研究。本文采用由湛江产马尾藻中提取的海藻多糖研究其对HL-６０细胞增殖的影响。
1材料与方法
１．１试剂与仪器海藻多糖(广东医学院刘秋英硕士惠赠)，RPMI-１６４０培养基(Gibco Co，ＵＳＡ)，四甲基偶氮唑(MTT，Sigma公司)，Hoechst 33258(Sigma公司)，碘化丙啶(PI，Sigma公司)，4000 ｍＰａ．ｓ甲基纤维素(Sigma公司)。仪器：OLYMPUS IMT-Ⅰ型倒置相差显微镜(Japan)，丹尼酶标仪(Denmark)，SW-ＣＪ-ＩＦＤ医用净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，SHZ-ＬＡＢ培养箱(UＳＡ）。
１．２方法
１．２．１细胞培养：HL-６０细胞株由广东医学院生化教研室提供。采用含10%新生牛血清终浓度为100 U／ｍｌ青霉素、链霉素的RPMI 1640液体培养体系，置37℃、5%ＣＯ２恒温培养箱中培养，隔天换液一次。实验选用对数生长期细胞。
１．２．２MTT抑制实验：参照文献［１，２］，将细胞以2×１０５／ｍｌ密度接种于96孔培养板中，加入不同浓度的药物，置37℃、5%ＣＯ２孵箱中分别培养24 ｈ、４８ ｈ、７２ ｈ后，每孔加入MTT(5 ｍｇ／ｍｌ）20 μｌ，继续培养4 ｈ，加入MTT裂解液(20%SDS＋５０％ＤＭＦ＋３０%Ｈ２Ｏ）１００ μｌ，３７℃、５％ＣＯ２孵箱中孵育8 ｈ，酶标仪检测各组细胞的A630／Ａ５７０值，计算抑制率(IR)。抑制率(IR)＝(１－用药组A值／对照组A值)×１００%。
１．２．３半固体培养：培养体系为2×１０２／ｍｌ细胞，RPMI 1640培养基，30%新生牛血清，不同浓度的药物，0.9%甲基纤维素，分别种入24孔板中，每孔1.5 ｍｌ，重复3孔，置37℃、５％ＣＯ２孵箱中培养，于第7天计算细胞集落数，以每团大于50个细胞为一个集落。
1.2.4形态学观察：培养体系为2×１０５／ｍｌ细胞，RPMI 1640培养基，马尾藻多糖终浓度分别为0(对照)、300、５００、８００ μｇ／ｍｌ，加入24孔板中，每孔2 ｍｌ，重复3孔，分别在1～５ d，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，并拍照。
1.2.5统计处理:本实验数据资料用ｘ±ｓ表示，使用SPSS10.0统计软件进行统计描述，采用SNK-q检验。
２结果
２．１MTT结果以不同浓度(0、５０、１００、２００、４００、８００ μｇ／ｍｌ)的海藻多糖作用于HL-６０细胞24 ｈ、４８ ｈ和72 ｈ，MTT法检测其对HL-６０细胞增殖的影响，见表１。随着海藻多糖浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐增加。当浓度为800 μｇ／ｍｌ，作用48 ｈ时抑制率为(51.３０±３.１０）％，与对照组相比差异有显著性(P＜０.０１）。
表1海藻多糖对HL-６０细胞增殖的抑制作用（略）
２．２集落培养结果海藻多糖对HL-６０细胞集落形成有明显的抑制作用，在100～８００ μｇ／ｍｌ浓度范围内，集落逐渐减少；浓度为800 μｇ／ｍｌ时未见有细胞存活，仅见残余细胞碎片；与对照组相比，差异有显著性(Ｐ＜０.０１），结果见表2。表2海藻多糖对HL-６０细胞集落形成的影响(ｘ±ｓ，ｎ＝３)浓度(μｇ／ｍｌ）集落数0219.67±６.４９50２０６.３３±３.７２１００１６４.８９±７.９３△200１０６.８９±３.９８▲４００２６.４４±１.５８▲８０００.００±０.００▲与对照组相比 △Ｐ＜０.０５，▲Ｐ＜０.０１；Ｆ＝１１２１.７５。
２．3海藻多糖对HL-６０细胞形态的影响处理后24 ｈ，各浓度组细胞形态与对照组未见明显差异，72 ｈ各处理组可见部分细胞核变大，约为普通细胞的1～２倍，以300 μg／ｍｌ组较多见。随着处理时间的增加，较大细胞逐渐增多，少数体积达到普通细胞的3～４倍，相差显微境下可见部分较大细胞先是核膜边缘出现多个突起后细胞核逐渐碎裂、分散，最终细胞破碎死亡。浓度越高，出现破碎死亡的细胞越多。
３讨论
白血病是人群发病率较高的恶性肿瘤之一，化疗是重要的治疗手段，但其副作用大是其几乎不可克服的缺点。在祖国医学中，中草药在抗肿瘤中的应用源远流长，如马尾藻等治疗乳腺癌和子宫癌。现代研究证明近100种中药多糖有不同程度的抗肿瘤作用。我们的研究结果表明，海藻多糖对HL-６０细胞增殖呈明显抑制作用，且随药物浓度的提高和作用时间的延长而增强。海藻多糖100 μｇ／ｍｌ作用24 ｈ即可见对HL-６０细胞增殖的抑制，当浓度为800 μｇ／ｍｌ、作用48 ｈ时抑制率为(51.３０±３.１０）％，与对照组相比差异有显著性(P＜０.０１）。其作用机制尚不清楚，已有研究表明可通过以下机制发挥抗白血病作用：①抑制DNA合成，干扰细胞代谢。刘力生等［３］报道螺旋藻多糖(PSP)对癌细胞的抑制作用主要是通过对DNA合成的抑制而起作用的。并认为PSP的抑癌机制属于代谢性抑制。②影响细胞酶的活性。Sogawa等［４］研究发现海藻多糖可完全抑制白血病K562细胞DNA拓扑异构酶活性，使白血病细胞不能无限增殖。③改变细胞膜的流动性。海藻多糖可提高S180荷瘤小鼠肿瘤细胞的膜流动性，降低H22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜流动性，通过恢复膜流动性至正常而达到抗肿瘤的作用［５］。此外，据报道多糖可通过影响免疫细胞功能［６，７］、细胞因子的表达［８］等途径发挥抗白血病作用。同时我们通过形态学观察则提示海藻多糖可能对细胞有一定的直接细胞毒作用，表现为高浓度时HL-６０细胞的碎裂死亡。海藻多糖体外可明显抑制HL-６０细胞增殖，提示其在抗肿瘤方面有一定的开发应用前景。
参考文献
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２． Hansen MB,Nielsen SE,Berg K.Re-ｅxamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill［Ｊ］．J Immunol Methods，１９８９，１１９（２）：２０３
３． 刘力生，郭宝红，阮继红．螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及其机理研究［Ｊ］．海洋科学，1991，5(1)：３３
４． Sogawa K,Ｙamada T,Sumida Ｔ，et al．Ｉｎduction of apoptosis and inhibition of DNA topoisomerase-Ｉ in K-５６２ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ［Ｊ］．Ｌife-Ｓｃｉ，２０００，６６（１６）：２２７
５． 季宇彬，高世勇，孔琦．海藻多糖对肿瘤细胞膜流动性的影响［Ｊ］．中草药，2002，33(5)：435
６． Liao HF,Chou CJ,Wu SH,et al. Isolation and characterization of an active compound from black soybean ［Ｇlycine max (L.) Merr.］ and its effect on proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells［Ｊ］．Ａnticancer Drugs,2001,12(10):841
７． 曾波航，王光明，曾亚仑．钝顶螺旋藻多糖对白血病患者外周血LAK细胞活性的影响［Ｊ］．中国海洋药物，2000，2(1)：39
８． 阎博民，于红．螺旋藻多糖抑制人肝癌细胞株RGF2 ｍＲＮＡ表达的研究［Ｊ］．实用癌症杂志，2003，18(5)：490
1 滨州医学院附属医院儿科滨州市256603； 2 滨州医学院教务处；3 广东医学院附属医院儿科