Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用

　　【关键词】  人参； Ri质粒；毛状根

　　Ri质粒介导的毛状根技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。它是将发根农杆菌含有的Ri质粒中的TDNA片段整合到植物细胞的DNA上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的生产［1］。由于Ri质粒转化的毛状根具有生长快、易于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点［２］，在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示出极大的应用潜力和广阔的发展前景。在利用Ri质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷、人参多糖等次生代谢物方面已经做了大量的研究。本文就该方面的研究作一综述。

　　1  Ri质粒转化形成毛状根的机制［3~7］

　　Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA，一般在180～250 kb之间，具有2个非常主要的功能区：TDNA区（Transferred DNA region）和Vir区（virulance region）。农杆碱型Ri质粒上的TDNA是不连续的，分为TLDNA和TR-DNA。TRDNA上带有编码农杆碱合成酶基因（ags）和生长素合成酶基因（tms1和tms2），后者指导IAA的合成。

　　发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个步骤：①发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成一种特殊的小分子化合物，如酚类化合物，从而诱导Ri质粒的Vir 区基因群活化；②在Vir 基因表达产生的酶的作用下，TDNA被切下；③TDNA 转移到植物细胞并整合到植物基因组DNA；④TDNA在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能，刺激植物细胞形成毛状根。

　　2  Ri质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分研究中的应用

　　众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取人参药物成分的工业化生产奠定了基础。

　　2.1  Ri质粒介导的人参毛状根转化体系建立的研究  最早在1987年，Yochikawa等［８］通过诱导人参的原生质体获得转化的毛状根，并首次证明人参毛状根完全有可能代替天然人参作药用。Inomata等［９］报道人参毛状根在培养的前两周生长很快，通过间隔一定时间更换培养基可保持毛状根的快速生长，培养32 d总人参皂苷含量相当于田间栽培5年生人参根中的皂苷含量水平。刘峻等［１０］首次从人参带叶幼茎处诱导出毛状根，并证实了在转化细胞中有农杆菌Ri质粒TDNA特异的表达产物冠瘿碱。

　　2.2  不同发根农杆菌株、培养基及成分、植物激素和诱导子等对人参毛状根生长及药效成分的影响  人参毛状根培养的最终目的是获得人参药用成分，对不同的发根农杆菌株、培养基及成分、植物激素和诱导子等条件的研究及其合理优化是提高人参毛状根生长量和药用成分的重要条件。

　　现有资料表明不同的菌株诱导毛状根的状况不同，刘峻等［１０］用发根农杆菌1601、LBA918、R1000、A4和15834等5种不同发根农杆菌感染人参，只有菌株15834可转化人参毛状根。赵寿经等［１１］利用A4菌株成功诱导了人参毛状根。而Shu等［１２］认为农杆菌ATCC15834形成的毛状根中人参皂苷的产量高于农杆菌MAFF0301724形成的人参毛状根。由农杆菌ATCC15834［１２］、农杆菌KTCT2744［１３］分别转化成的毛状根，在不同的培养条件下，分别生长最好，人参皂苷的产量最高。Liu等［１４］研究认为Ri质粒中TDNA片段中rolA、rolB基因对毛状根中人参皂苷产量的影响很小，而rolC基因对人参毛状根中人参皂苷产量的提高具有重要作用。

　　孙彬贤等［１５］研究了由发根农杆菌15834诱导的人参毛状根在不同培养基上的生长和人参皂苷的含量变化，确定了最佳的培养基和培养条件。培养基中不同的元素成分也对人参毛状根皂苷的生成有重要影响。硝态氮源有助于人参毛状根中人参皂苷的生产，而氨态氮源抑制人参皂苷的生产；增加培养基中大量元素钾、镁、钙的含量或降低微量元素钴、铜、碘的含量能提高人参皂苷的产量，提高锰的含量也有提高人参皂苷产量的效果［１６］。

　　周倩耘等［１７］认为适宜浓度的IAA、IBA、NAA、2，4D植物激素，均可不同程度地促进人参毛状根的生长以及皂苷的积累，同时能影响单体皂苷的分布。刘峻等［１８］认为用NAA、KT和乙酰丁香酮处理可提高人参毛状根转化率并缩短转化时间。

　　周倩耘等［１８］研究了诱导子水杨酸（SA）、酵母提取物（YE）、AgNO3和CaCl2对人参毛状根中皂苷含量的影响，认为诱导子可能是调节人参毛状根中皂苷积累的有效物质，而且SA能促进人参皂苷分泌到细胞外并在培养液中积累。刘峻等［１９］认为真菌诱导子不但能影响人参毛状根总苷的合成量，也能使某些单体皂苷消失或增加，同时也影响人参毛状根的生物量，培养过程中通过外源性诱导子的添加，有利于人参毛状根次生代谢产物的定向积累。化学诱导子茉莉酮酸有显著促进人参毛状根中人参皂苷积累和提高人参皂苷Rb族所占比例的作用［２０］。　

　　2.3  人参毛状根生理生化活性的研究  刘峻等［２１］对人参愈伤组织及转化的毛状根在生长周期中ATP的动态含量进行测定和比较，相对人参愈伤组织，人参毛状根是分生代谢能力较强的组织，其次生代谢产物人参皂苷的合成能力也较愈伤组织强。他们又研究了人参毛状根培养过程中对3种重要活性氧ROS清除能力的动态变化，结果符合人参毛状根生长的S型曲线，印证了人参毛状根的生长和衰老过程［２２］。初步验证了毛状根是一类分生代谢能力很强的组织。

　　2.4  利用人参毛状根进行生物转化的研究  用植物培养物对外源底物进行生物转化,从而对其结构进行修饰,以获得更有意义的产物的研究报道很多,也是当今研究的热点［２３］。

　　赵明强等［２３］对人参毛状根转化熊果苷的基本条件进行了初步探讨，并获得了转化产物熊果苷，栗建明等［２４］进一步对此转化产物进行了分离鉴定，认为用人参毛状根能够将氢醌转化为熊果苷。蔡洁等［２５］利用人参毛状根生物转化合成了天麻素。还有学者利用人参毛状根进行毛地黄毒苷元(digitoxigenin)［２６］和18β甘草亭酸(18βglycyrrhetinic acid)［２７］的生物转化,获得了多种酯化和糖基化产物。

　　2.5  人参毛状根的生物反应器培养  生物反应器培养是实现工业化生产的前提。人参细胞的工业化大规模培养早在20世纪80年代已经在日本实现，人参不定根的大规模反应器培养也在韩国投产［２８］。由于毛状根培养在植物组织和细胞培养中所具有的优势，开发人参毛状根的生物反应器培养研究将为人参药用成分的大规模工业化生产带来更大的机会。

　　Palazon等［２９］进行了人参毛状根的生物反应器培养研究，认为在各种反应器中，波浪式反应器最利于人参毛状根的生长，定期补充和更新培养基以及长期培养，可以提高人参毛状根的产率和合成人参皂苷的能力。Jeong等［３０］的实验表明，在5 L的生物反应器中，经过39 d的培养，毛状根的生物量是接种时的55倍；在19 L的生物反应器中，经过40 d的培养，毛状根的生物量是接种时的38倍。

　　3  展望

　　综上所述，Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分方面得到了大量的应用，但在基础研究方面研究的较多，且大部分研究都局限于实验室。真正能应用于工业化生产的研究还比较少，虽然有报道人参毛状根培养已开发成商品投入市场［３１］，但是现在在人参药材的应用上仍然以栽培为主，2004年的栽培人参干品产量大约在5 000～5 500吨［３２］。而通过生物技术生产人参药用成分上占据的比例非常小。在目前状况下，大规模的种植，所带来的问题也是比较突出［３３］。加快生物技术在获取人参药用成分中的应用，必将缓解这一系列的问题。

　　毛状根技术作为重要的细胞工程技术之一，加快人参毛状根生成药用成分代谢途径和调控机制的研究、建立新的毛状根培养方法和毛状根大规模培养技术、研制新型的生物反应器、积极进行Ri质粒介导外源基因在人参毛状根中表达的研究等，将为人参毛状根技术在人参药用活性成分的工业化生产提供重要的技术支持，特别是毛状根大规模培养技术和新型生物反应器的研究将为人参药用成分的工业化生产提供广阔的前景。

　　参考文献

　　1 芮和恺.药用植物毛状根的研究和应用［J］.自然杂志，1997，19（1）：23

　　2刘军，彭菲. Ri质粒介导药用植物的研究进展［J］. 湖南中医学院学报，2004，24（3）：61

　　3刘琴，吴震，翁忙玲，等.发根农杆菌Ｒｉ质粒及其在植物科学中的应用［J］. 生物技术通报，2002，（5）：21

　　4 王关林.发根农杆菌Ｒｉ质粒载体转化.植物基因工程原理与技术［M］.北京：科学出版社，1998. 237

　　5管延英，燕飞，杨小楼.发根农杆菌转化药用植物研究进展［J］.保定师范专科学校学报，2003，16（2）：24

　　6罗成科，彭正松，蒲利民.发根农杆菌介导的药用植物遗传转化［J］. 生物技术，2004，14（1）：58

　　7王占斌，徐香玲，孙仲平，等. 发根农杆菌Ri质粒在药用植物生物工程中的应用［J］.生物技术，2002，12（3）：43

　　8Yoshikawa T，Furuya T. Saponia production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes［J］. Plant Cell Rep，1987，6（6）：449

　　9Inomata S，Yokoyama M，Gozu Y，et al. Growth pattern and ginsenoside production by transformed Panax ginseng roots ［J］. Plant Cell Rep，1993，12：681

　　10 刘峻，丁家宜，徐红，等.Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定［J］. 中国中药杂志，2001，26（2）：95

　　11 赵寿经，杨振堂，李昌禹，等.发根农杆菌诱导人参产生发根及离体发根中人参皂甙含量的测定［J］.吉林农业大学学报，2001，23（2）：57

　　12Shu W, Yoshhimatsu K, Shimomura K. High production of ginsenosides by transformed root cultures of Panax ginseng effect of basalmedium and Agrobacterium rhizogenes strains［J］. Koluritsu Iyakwhin Shokwh in Eisei Kenkynsho Hokoku, 1999，117：148

　　13Jeong GT, Park DH, Ryu HW, etal. Optimum conditions for transformed Panax ginseng hair roots in flask culture［J］.  Appl Biotechnol，2002， (98/100)：129

　　14Liu J, Ding JY, Wang JB. Genetic transformation of Panax ginseng C. A. Mey. Induced by root inducing plasmid (Ri) of Agrobacterium rhizogenes［J］.Chin Med Mater，2001，26（2）：95

　　15孙彬贤，杨光孝，汪沁琳，等.人参毛状根合成人参皂苷培养条件的优化［J］.中成药，2003，25（9）：746

　　16Yu K W，Hahn E J，Paek K Y. Effects of NH4+：NO3- ratio and ionic strength on adventitious root growth and ginsenoside production in bioreactor culture of Panax ginseng CA Meyer［J］．Acta Horticulture，2001，560：259

　　17周倩耘，丁家宜，刘峻，等.植物激素对人参毛状根生长和皂甙含量的影响［J］. 植物资源与环境学报，2003，12（1）：26

　　18 周倩耘，周建民，刘峻，等.诱导子对人参毛状根中皂苷含量的影响［J］.南京军医学院学报，2003，25（2）：76

　　19 刘峻，丁家宜，周倩耘，等. 真菌诱导子对人参毛状根皂苷生物合成和生长的影响［J］. 中国中药杂志，2004，29（4）：302

　　20 Yu KW，Gao WY，Son SH，et al．Improvement of ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitors in hairy root culture of ginseng （Panax ginseng C.A. Meyer）［J］. In Vitro Cell Dev Biol Plant，2000，36（5）：424

　　21刘峻，丁家宜，张婷.人参毛状根及愈伤组织中ATP动态变化的生物发光法测定［J］. 植物资源与环境学报，2001，10（2）：61

　　22 刘峻,丁家宜,周倩耘.人参毛状根培养过程中对活性氧清除能力的动态变化［J］. 植物资源与环境学报，2002，11（4）：22

　　23赵明强，丁家宜，刘峻，等.人参毛状根生物合成熊果苷的研究［J］.中国中药杂志，2001，26（12）：819

　　24栗建明，赵明强，丁家宜.人参毛状根生物合成熊果苷的分离与鉴定［J］.植物资源与环境学报，2004，13（1）：60

　　25蔡洁，丁家宜，华亚男，等.人参毛状根生物合成天麻素转化体系的建立［J］.植物资源与环境学报，2005，14（2）：29

　　26Kawaguchi K，Hirotani M，Yoshikawaetal T. Biotransformation of Digitoxigenin by Ginseng Hairy Root Cultures［J］. Phytochemistry，1990，29（3）：837

　　27Asada Y，Saito H，Yoshikawa T，et al. Biotransformation of 18glycyrrhetinic acid by Ginseng Hairy Root Culture［J］. Phytochemistry，1993，34（4）：1049

　　28陈巍，高文远，贾伟，等. 人参属药用植物组织和细胞培养的研究进展［J］. 中草药，2005，36（4）：616

　　29Palazon J, Mallol A, Eibl R,et al. Growth and ginsenosid  production in hairing root culture of Panax ginseng using novel bioreactor［J］. Planta Med，2003，69（4）：334

　　30Jeong GT, Park DH, Hwang B, et al. Comparison of growth characteristics of Panax ginseng hairing roots various bioreactors［J］.Appl Biochem Biotechnol，2003，（105-108）： 493

　　31 胡之璧．生物技术在传统药材中的应用前景［J］．药学服务与研究，2002，2（1）：1

　　32丁乡，丁立威．国宝人参曙光再现——东北三省人参市场现状与后市浅析［J］.中国中医药报，2005，11:2

　　33 高文远，贾伟，段宏泉，等.药用植物发酵培养的工业化探讨［J］.中国中药杂志，2003，28（5）：385
  
　　滨州医学院生物技术教研室  滨州市  256603