硝矾洗剂对念珠菌的敏感性检测

　　【关键词】  硝矾洗剂；念珠菌；真菌

　　近几年来，由于广谱抗菌素、放化疗的广泛应用，真菌病的患者发病率逐年增高，虽然抗真菌药物的出现给真菌病患者的治疗带来新的转机，但由于其价格高，毒副作用大的特点，使患者难以接受。国内许多患者将研究重点转移到中药抗真菌作用机制方面。硝矾洗剂，具有清热解毒、杀虫、燥湿止痒之功效，目前已广泛应用于临床治疗浅部真菌病。本实验应用NCCLSM27A液基试管法，并在此基础上进行改良，检测硝矾洗剂及其组方对临床常见致病性真菌念珠菌进行敏感性检测。

　　1  材料与方法

　　1.1  中药的提取  取生药硼砂3 g、扑硝3 g、明矾3 g溶解于30 ml蒸馏水中，配成药物原液100 mg/ml，混合液以三种药物原液等量配制，浓度100 mg/ml，贮存备用。

　　1.2  实验菌株   本实验菌株来源本院真菌实验室，通过念珠菌显色培养基，确定实验菌株，白色念珠菌10株，近平滑念珠菌5珠。

　　1.3  培养基的制备  改良沙氏液基（SDB）：按常规方法配制2倍浓度的含2%葡萄糖的培养基。

　　1.4  实验方法

　　141  中药洗剂液体培养基的制备：将06 ml浓度为100 mg/ml中药贮存液用04 ml蒸馏水稀释，再用1 ml2倍浓度的含2%葡萄糖的培养基等量稀释，配成浓度为30%的药物液基，其它浓度依次类推，其药物浓度为30%、20%、10%、5%、25%、125%、075%、05%、025%，由高浓度到低浓度依次进行，第11管为生长对照，12管为空白对照。将调好的菌接种液20 μl分别入相应试管中。

　　142  菌悬液的制备： 念珠菌：①受试菌株应经2次SDA培养活化，以确保菌落的纯化和活力（培养温度35℃）。②经35℃、24 h培养，取5个直径大于1mm的菌落于5ml无菌盐水（085%）中制成悬液,震荡15 s。③用血细胞计数板将其浓度调至1×105~5×105 CFU/ml。

　　143  接种：将调好的菌接种液20 μl分别加入相应的试管内，这将使每一梯度的菌悬液终浓度：念珠菌药敏实验1×103~5×103 CFU/ml。

　　144  结果的判定：念珠菌实验经35℃48 h后观察结果。在不搅动的情况下与对照孔按下列标准比较：0：肉眼清晰；1：略模糊（80%受抑制）；2：浊度显著减低（50%受抑制）；3：浊度轻度减低；4：浊度未减低。念珠菌实验结果取1为判定终点。

　　145  设置对照：建立第11管为生长对照孔，12管为空白对照（只用培养基不加菌）。只有当生长对照生长良好，并且其它孔随药物浓度升高、菌生长梯度受抑制时方证明实验成功；空白对照无真菌生长。同时为减少由于药物沉淀而影响实验结果的准确性，每一次实验每一次试管都进行药物对照（只加药物不加菌），使实验结果易于判断准确。

　　15  统计学方法  数值大于最高浓度按上一级浓度计算，将所有数据经平方根转换后进行单因素方差分析ANOVA，同时对各组之间的差别进行SNK分析。

　　2  结果

　　所有菌的生长对照均生长良好，阴性对照均未见菌落生长，中药处理组随药物浓度升高表现出菌生长受到抑制。值得解释的是：由于明矾和混合液的实验中药物与培养基混合时出现乳状浑浊，在实验的4、5、6、7、8、9管中尤为明显，直接影响实验的判读结果。因此，在明矾和混合液实验中，将已实验的培养基进行离心机离心15 min之后，取10 μl溶液进行沙氏培养基平皿点状接种培养，以未见念珠菌生长的药物最高浓度点确定为药物的MFC值。四种中药及其混合液对15株念珠菌的药物敏感性见表1。

　　表1  15株念珠菌对不同药物MIC范围及均值（略）

　　单因素方差分析结果：F=258，P＜0001，组间差异有统计学意义。对各组之间的差别再进行SNK分析可以看出，硼砂组、扑硝组和混合组的MIC或MFC值均低于明矾组（P＜005），但硼砂组、扑硝组和混合组之间差异无统计学意义；混合液的效果优于明矾组，但弱于硼砂组、扑硝组、明矾组。

　　3  讨论

　　目前，硝矾洗剂已在临床工作中广泛应用，取得了一定的疗效，因此，本实验以美国NCCLSM27A液基法［1］为依据，进行复方及单方中药的水溶液体外药敏实验，旨在探讨硝矾洗剂的抗真菌敏感性，为中药抗真菌实验标准化方案的建立打下理论基础。上述实验结果看出，硼砂对念珠菌的敏感性好，MIC值05~5 mg/ml具有广谱抗真菌特点；混合液对念珠菌的敏感性好，虽然MFC值均值459 mg/ml，在数值上高于硼砂,但混合液结果是MFC值,因此硼砂和混合液抗真菌敏感性难以确定,尚不能认为各药之间有协同或相抵作用；扑硝对念珠菌敏感性好，MIC值435 mg/ml；明矾对念珠菌的敏感性次之，MFC均值1027 mg/ml，与以往的实验结果不符［2］，可能与取MFC值有关，但能进一步表明，明矾具有较好的杀真菌作用。中医认为，浅部真菌病多由感染湿热之毒、蕴积皮肤、邪相染所致，其治法以清热解毒、燥湿杀虫止痒为主。研究表明，硼砂辛苦咸凉，外用可清热解毒，防腐杀虫，芒硝、明矾酸涩寒，有收敛性，外用可解毒杀虫、燥湿止痒［3］。硼砂、芒硝和明矾在临床上广泛应用，可达到清热解毒、燥湿收敛之功效，三药合用相得益彰，适于浅部真菌病的治疗，特别适合于合并细菌感染或急性渗出的病例，因此具有广泛的临床使用前景。

　　明矾和混合液实验中，当药物与培养基混合时，出现乳状浑浊，这是由于明矾一遇到水发生水解反应，生成白色絮状的沉淀物氢氧化铝，可发生沉淀，影响MIC值的判定。因此，本实验明矾和混合液实验以MFC值为实验结果，进一步说明液基法药敏实验虽然实验结果较固基法更准确，但实验有一定局限性。

　　参考文献

　　1National committee for clinical laboratory standards Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27A ［J］ Pennsylvania:NCCLS,1997,（1）:21

　　2何定淑，王淑美，何淑惠，等硝矾散及其拆方对红色毛癣菌和须癣毛癣菌体外药敏作用研究［J］实用中医药杂志，2005，21（11）:674

　　3赵辨临床皮肤病学［M］第3版南京：江苏科学技术出版社，20011415

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