点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨患者外周血细胞膜上CD55和CD59缺陷对鉴别诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿（parosysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH）与贫血（anemia）的意义。方法 采用荧光素标记的CD55和CD59单克隆抗体，流式细胞术检测30例正常人、32例再生障碍性贫血（AA）、28例阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）或AAPNH综合征、38例小细胞低色素性贫血（IDA）、24例巨幼细胞性贫血（MA）、12例自身免疫溶血性贫血（AIHA）患者外周血中红细胞及中性粒细胞CD55-和CD59-的百分率。结果 CD55-、CD59-正常人红细胞和中性粒细胞的百分率均＜5%；PNH或AAPNH患者均＞20%；部分再障患者＞5%（均＜15%）。约有40%的小细胞低色素贫血患者CD55-、CD59-红细胞＞5%（均＜20%）；但中性粒细胞CD55-、CD59-百分率均＜5%。巨幼贫、自身免疫溶血性盆血患者的CD55-、CD59-红细胞和中性粒细胞均＜5%。结论 利用流式细胞术同时检测患者外周血中红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59缺陷是临床鉴别诊断PNH、AAPNH及再障、小细胞低色素性贫血、巨幼贫及自身免疫溶血性贫血可靠，较敏感的方法。
【关键词】 阵发性睡眠性血红蛋白尿；贫血；流式细胞术；CD55；CD59；鉴别诊断
Significance of CD55/CD59 deficiency analysis on peripheral blood cells in differentiation from PNH with anemia
RUAN Yueqin HAN Zhaodong LI Caiyu et al
Central Laboratory,Affiliated Hospital of Binzhou Medical Uninversity,Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To evaluate the significance of deficiency of CD55/CD59 on peripheral blood cells in differentiation and diagnosis of PNH and anemia.Methods CD55/CD59monoclonal antibodies labeled by fluorescence were used to analyze percentage of CD55/CD59 on erythrocyte and neutrophil in 30 normal subjects,32 cases of AA，28 cases of PNH or AAPNH,38 cases of IDA,24 cases of MA and 12 cases of AIHA patients with flow cytometry.Results The percentage of CD55/CD59 on erythrocyte and neutrophil in normal subjects were less than 5%，in PNH or AAPNHS patients were more than 20% and in some of AA patients were more than 5%(They were all less than 15%).The percentage of CD55-/CD59- on erythrocyte in about 40% IDA patients were more than 5%(They were all less than 20%),while on neutrophil were less than 5%.The percentage of CD55-/CD59- on erythrocyte and neutrophil in MA and AIHA patients were all less than 5%.Conclusion The peripheral blood cells CD55/CD59 deficiency on erythrocyte and neutrophil analyzed by FCM is the most reliable and sensitive test in differentiation and diagnosis of PNH,AAPNH,AA,IDA,MA and AIHA.
【 Key words】 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,anemia,flow cytometry,CD55,CD59,differentiation
阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是造血干细胞基因突变的克隆性疾病，其异常血细胞膜上糖基磷脂酰肌醇（GPI）生成障碍，导致患者血细胞膜上GPI锚定的表面分子CD55、CD59表达明显减低或缺乏，因而对正常血清中的补体特别敏感而发生溶血。以往对PNH的实验室诊断主要依赖酸溶血实验，此方法仅限于测定红细胞对补体的敏感度，只有患者外周血受累细胞膜上CD55、CD59缺陷达一定比例时才有可能阳性，故其敏感性受限，使部分PNH患者难以确诊。流式细胞术检测外周血红细胞和中性粒细胞CD55、CD59是目前大多数实验室用来作为诊断阵发性血红蛋白尿（PNH）的首选实验［1］。我院采用荧光素标记的CD55和CD59单克隆抗体，流式细胞术检测30例正常人、32例再生障碍性贫血（AA）、28例PNH或AAPNH综合征、38例小细胞低色素性贫血（IDA）、24例巨幼细胞性贫血（MA），12例自身免疫溶血性贫血（AIHA），患者外周血红细胞及中性粒细胞CD55-和CD59-的百分率，其结果明显不同。现将结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料
111 标本来源：30例健康体检者作为正常对照组，均排除血液病。其中男17例，女13例，平均年龄26岁；为门诊体检合格者；PNH组13例，其中男7例，女6例，平均年龄36例；AAPNH组15例，其中男9例，女6例，平均年龄33岁；AA组32例，其中男18例，女14例，平均年龄32岁；IDA组38例，其中男20例，女18例，平均年龄35岁；MA组24例，其中男10例，女14例，平均年龄35岁；AIHA组12例，其中男7例，女5例，平均年龄29岁。所有患者均为我院门诊及住院病人，均符合血液病的诊断标准［2］。
112 标本采集：抽取肘静脉血2 ml置于EDTAk2抗凝管中，轻轻混匀待用。
113 试剂：CD55FITC和CD59PE荧光单克隆抗体及红细胞裂解液ImmunoprepTM试剂，IsotonⅢ稀释液（PBS）均购自法国Immunotech公司。
114 仪器：美国BeckmanCoulter公司产FC500型流式细胞仪及Coulter QPREP溶血制备仪。
12 方法
121 红细胞标记及检测：①每个待测标本均取5 μl EDTAk2抗凝外周血加至含995 μl PBS的试管中轻轻混匀（200倍稀释）；②对照管：取20 μl正常人红细胞悬液于流式专用试管中，分别加入20 μl CD55和CD59荧光单克隆抗体；样品管：取20 μl患者红细胞悬液于流式专用试管中，分别加入20 μl CD55和CD59荧光单克隆抗体。③混匀，室温避光15 min后加PBS 1 ml，上机检测。
122 中性粒细胞标记及检测：①分别取100 μl抗凝全血于流式专用试管中用ImmunoprepTM试剂溶血，离心10 min（500 r/min）弃上清，用PBS洗3次，加PBS调整细胞浓度为1×106/μl。②对照管：取100 μl正常人中性粒细胞悬液于流式专用试管中，分别加入20 μl CD55或CD59荧光单克隆抗体；样品管：取100 μl患者中性粒细胞悬液于流式专用试管中，分别加入20 μl CD55或CD59荧光单克隆抗体。③混匀，室温避光15 min后加PBS 1 ml，上机检测。
2 结果
正常对照组、PNH、AAPNH及IDA、MA、AA、AIHA各组细胞CD55、CD59缺陷结果见表1。
表1 各组红细胞及中性粒细胞CD55、CD59检测结果（略）
3 讨论
近年来的研究已证明补体调节蛋白CD55和CD59细胞膜上缺失是PNH发病的关键［3］。由于GPI的合成发生在造血干细胞水平，所以，在外周血的三系细胞膜上都有CD55和CD59的表达异常。但只有红细胞和中性粒细胞的CD55和CD59表达更具有特异性和敏感性，且易于检测［4］。我们的检测结果表明，30例正常人及24例巨幼细胞性贫血、12例自身免疫溶血性贫血（AIHA）患者外周血红细胞和中性粒细胞CD55-和CD59-的百分率均＜5%；13例PNH和15例AAPNH综合征CD55-和CD59-的百分率均＞5%；32例再生障碍性贫血患者中有8例CD55-和CD59-的百分率＞5%，但均＜15%；说明部分再障病人的红细胞和中性粒细胞中也有PNH样阴性细胞存在，只是程度较PNH病人轻。提示再障病人也有克隆异常性造血，与吕照红等［5］报道一致。38例小细胞性贫血患者有15例红细胞CD55-和CD59-的百分率＞5%，均＜20%；但中性粒细胞CD55-和CD59-的百分率均＜5%。至于为何小细胞低色素性贫血患者红细胞会有PNH样阴性细胞出现而粒细胞正常的原因不清楚。由于缺铁是造成小细胞低色素性贫血的主要原因，PNH病人从尿中大量丢失铁，也有小细胞低色素性贫血的表现［6］。因此，同时检测红细胞和粒细胞的CD55和CD59的表达情况有助于鉴别PNH和小细胞低色素性贫血。综上所述，我们认为利用流式细胞术同时检测外周血中的CD55-和CD59-红细胞和中性粒细胞，是诊断和鉴别诊断PNH及AAPNH与IDA、MA、AIHA、AA贫血较可靠、敏感的方法。
参考文献
1Pilar MH,MA,Julia Almeida,et al.Comparative analysis of different flow cytometrybased Immunophenotypic methods for the analysis of CD59 and CD55 expression on major peression on major blood cell subsets［J］.Clin Cytometry,2002,50:191201
2张志南.血液病诊断剂疗效标准［M］.第2版.北京：北京科学出版社，1998.8896
3Norris J,Hall S,Ware RE,et al.Gycosylphosphatidy linositol anchor synthesis in parosysmal nocturnal hemoglobinuria:partial or complete defect in an early step［J］.Blood,1994,83:816820
4徐从高，张锑，赵睿，等.补体调节蛋白在三种干细胞缺陷性贫血中的表达及其意义的研究［J］.中华血液学杂志，1999，20（10）：511514
5吕照江，张之南，李达，等.从再生障碍贫血患者检出阵发性血红蛋白尿症异常细胞的观察［J］.中华血液学杂志，1997，18（10）：521524
6安德约利，主编.陈灏珠，主译.西氏内科学精要［M］.西安：世界图书出版公司，1996
滨州医学院附属医院检验科 滨州市 256603；滨州医学院附属医院中心实验室