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跨膜型CD59分子的构建及其在小鼠NIH3T3和EL-4细胞表达的研究
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 基础免疫学
作者：白 云 姜 曼 韩根成 王更银 朱锡华
单位：白 云 姜 曼 韩根成 朱锡华 第三军医大学基础部免疫学教研室 重庆 400038；王更银 白求恩国际和平医院检验科 石家庄 050026
关键词：CD59；跨膜型；补体；基因表达
摘 要 应用RT-PCR方法，从U937细胞总RNA中扩增得到编码人CD46分子跨膜区和膜内区cDNA片段，用PCR方法扩增得到编码成熟的CD59胞外区蛋白的cDNA片段，连接并构建了跨膜型的CD59分子cDNA。快速克隆于pGEM-T Easy载体进行序列测定，证实了其阅读框的完整和序列的正确性。进一步将cDNA重组于逆转录病毒pLXSN载体，电穿孔转染PA317细胞，用病毒上清感染小鼠NIH3T3、EL-4细胞，经FACS检测筛选获得表达重组CD59TM分子的阳性细胞克隆。本研究为更深入地研究GPI锚固的CD59分子与细胞活化信号转导的关系建立了可靠的细胞模型；同时也为探讨应用跨膜型的CD59分子对PNH进行基因治疗奠定了良好的基础。
中图号 R392.12
RECOMBINATION AND EXPRESSION OF TRANSMEMBRANE FORM OF HUMAN CD59 ON MOUSE NIH3T3 AND EL-4 CELLS
Bai Yun，Jiang Man，Hang Gencheng，Wang Gengyin，Zhu Xihua
（Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038）
Abstract In this paper，the transmembrane form of CD59（CD59-TM） cDNA was constructed by linking the extracellular portion of CD59 to the transmembrane and cytoplasmic domains of MCP，which was amplified by RT-PCR method from total RAN of U937 cells．The fused cDNA fragement was cloned into pGEM-Easy plasmids and sequenced．The recombinant CD59-TM cDAN was further subcloned into retroviral vector pLXSN and after transfected into packaging cell line PA317，mouse fibroblasts and thymotase cell line EL-4 were infected with the virus resulting in stable expression of CD59-TM on the cell surface．The success of construction and expression of CD59-TM molecule on NIH3T3 and EL-4 cells provides a useful model to study the significance of the GPI anchor in si-gnal transduction，and also pave a way for retroviral gene therapy for PNH patients．
Key words CD59，Transmembrane form，Complement，Gene expression
CD59分子是补体系统终末阶段的调节蛋白，它以同源限制的方式抑制攻膜复合物C5b-9的生成，保护自身正常组织细胞免受补体损伤［1，2］。CD59的异常和缺损可导致红细胞对自身补体的敏感性增加，是引起夜间阵发性血红蛋白尿（PNH）的直接原因［3，4］。在天然状态下，CD59通过肌醇磷脂酰聚糖（GPI）锚固于细胞膜，广泛分布于各组织细胞表面，GPI锚结构的缺失或异常也可导致CD59表达的缺失。目前的研究表明，大多数PNH是由于与合成GPI糖脂链核心部分有关的PIG-A类基因突变，导致GPI锚合成障碍所致。在这种情况下，显然不能通过导入天然的GPI-锚固型的CD59基因来对PNH实行基因治疗，而导入并表达有功能的跨膜型CD59分子可为其基因治疗提供一条可尝试的途径。此外，GPI锚固的CD59是一个重要的信号转导分子，参与了单核细胞、粒细胞、血小板、T细胞的活化信号转导过程，尤其是在T细胞活化中的辅助刺激作用倍受人们的关注［5～7］。GPI锚在信号转导中的作用也是急待阐明的问题之一。本室在以前的研究中，已经获得了CD59的全部编码cDNA序列，并成功地构建了表达GPI锚固型CD59分子的小鼠NIH3T3、EL-4细胞模型［8，9］。本研究的目的在于构建跨膜型的CD59分子cDNA，并将其表达于小鼠NIH3T3和EL-4细胞。一方面为更深入地研究GPI锚固的CD59分子与细胞活化信号转导的关系提供可靠的细胞模型；同时也为探讨应用跨膜型的CD59分子对PNH进行基因治疗奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 质粒载体pGEM-T Easy购自Promega公司；逆转录病毒载体pLXSN为本室保存；TitanTM One Tube RT-PCR试剂盒购自BOEHRINGER MANNHEIM公司；限制性内切酶、T4连接酶购自华美公司；anti-CD59单抗2A7由本室制备。G418购自Promega公司；U937、PA317、NIH3T3和EL-4细胞系由本室保存。
1.2 引物设计和合成 设计合成2对引物，引物1和2用于扩增编码CD59的胞外区1-77aa的cDNA序列，其3’-端加上一个Ssp Ⅰ酶切位点。引物3和4用于扩增编码CD46的跨膜区及膜内区270～350aa部分的cDNA序列，5’-端引物利用了其自身的Stu Ⅰ位点，而在3’-端引物中引入一个Xba Ⅰ位点。PCR引物由上海细胞研究所合成。
Primer1： 5-GAATTCATGGGAATCCAAGGAGG-3
Primer2： 5-CGCGAATATTTTCAAGCTGTTCG-3
Primer3： 5-CGCGAGGCCTACTTACAAGCCTCCAG-3
Primer4： 5-CGTCTAGACTATTCAGCCTCTCTGCTCTGC-3
1.3 细胞总RNA的提取 采用CD46高表达的U937细胞系，参照异硫氰酸胍一步法［10］提取总RNA，提取物于1.5％的琼脂糖凝胶上行甲醛变性电泳。
1.4 RT-PCR扩增CD46-TM cDNA片段 参照TitanTM One Tube RT-PCR System说明书并加以改进。以U937细胞总RAN为模板，用引物3和4进行RT-PCR扩增，取8μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳观察结果。扩增片段以EcoR V酶切鉴定。
1.5 PCR扩增CD59胞外区cDNA片段 以完整的CD59 cDNA为模板，用引物1和2扩增CD59信号肽及1-77aa编码序列，扩增片段以Pst Ⅰ酶切进行初步鉴定。
1.6 CD59-TM cDNA的连接 将上述PCR产物纯化回收，分别用Ssp Ⅰ和Stu Ⅰ酶切，纯化回收后用T4连接酶连接，然后再用引物1和4进行PCR扩增，PCR反应程序为94°C变性60s；55°C退火60s；72°C延伸90s，周期为30个循环，最后72°C延伸10min。取8μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳观察结果，分离纯化560bp片段。该扩增片段以Pst Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切进行初步鉴定。
1.7 基因克隆和序列分析 将上述PCR产物与pGEM-T载体连接，转化入E．coli JM109后经氨苄青霉素及α-互补筛选，用EcoR Ⅰ酶切鉴定，得到含有560bp插入片段的重组质料。DNA序列分析由上海公司进行自动测序操作。
1.8 重组表达质粒pL-MCP的构建 按图4的方案进行，DNA重组技术如DNA片段的回收、酶切、连接、转化等均参照文献［11］方法。
1.9 基因转染 按文献［11］的方法，用电穿孔法将pL-MCP质粒导入PA317细胞，同时导入pLXSN空载体对照；G418加压筛选重组细胞克隆，收集病毒上清，感染NIH3T3细胞和EL-4细胞，加G418筛选重组细胞克隆。
1.10 FACS检测重组细胞CD59-TM的表达 随机挑选pL-MCP感染的NIH3T3细胞和EL-4细胞，调整为1×105／ml，用anti-CD59 mAb 2A7进行免疫荧光染色。用FACScan进行流式细胞分析。
2 结果
2.1 CD46-TM片段和CD59胞外区cDNA的扩增 CD46广泛分布于人体各组织细胞表面，但在不同的组织细胞的表达有所差异。我们选择高表达的U937细胞为原材料抽提总RNA，电泳结果显示不同批次抽提的RNA28S、18S、5S三带明显，且28S＞18S。紫外测定表明A260／A280＞1.8，说明抽提的总RNA完整，且纯度符合反转录要求。本实验按说明书方法，以反义引物3和4进行RT-PCR，扩增所得的产物较少，有非特异性产物存在，结果不理想。后经多次改进，最终获得258bp的单一片段。以CD59的完整的cDNA为模板，PCR扩增CD59胞外区cDNA获得314bp的片段（见图1）。
图 1RT-PCR及PCR产物电泳图谱
Fig 1Electrophoresis for RT-PCR and PCR produc-
tion on 1．5％ agarose gel
Line 1：DNA markers
Line 2：RT-PCR production of CD46-TM
Line 3：PCR production of CD59（-25～77aa）
2．2 CD59-TM cDNA的连接及克隆 上述PCR产物分别用SspⅠ和Stu Ⅰ酶切后用T4连接酶连接，然后再用引物1和4进行PCR扩增，分离产物中的572bp大小的片段。该扩增片段以SspⅠ和Stu Ⅰ酶切证实上述酶切位点消失，用Pst Ⅰ酶切可切除约75bp的编码CD59信号肽的片段，初步证实所扩增的片段可能是重组CD59-TM的cDNA片段。进一步将扩增的cDNA片段与质粒pGEM-T Easy连接，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，用EcoR Ⅰ酶切鉴定，阳性重组子可切出572bp的片段（见图2），说明cDNA已克隆于载体中，命名为pGEM-CD59TM。
图 2重组CD59-TM cDNA的酶切鉴定图谱
Fig 2Restriction map of recombinant CD59-TM cDNA
Lane1：λ DNA／HindⅢ Markers
Lane2：Lingered CD59-TM cDNA
Lane3：CD59-TM cDNA digested with Pst Ⅰ
Lane4：pGEM-CD59TM digested with EcoR Ⅰ
2.3 克隆片段的DNA序列分析 pGEM-T Easy是可以直接测序的载体，因此我们以重组质粒为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列（图3），经分析发现：由于引物合成的错误，原设计的3端Xba Ⅰ位点消失。但两个片段的连接部位序列正确，阅读框完整，无移码和错码。与预测的包括25aa信号肽序列的重组CD59-TM型cDNA序列一致，表明我们已经克隆获得了重组CD59-TM型cDNA的全部编码序列。
图 3重组质粒pGEM-CD59TM的克隆片段序列
Fig 3Sequence of recombinant CD59-TM cDNA
2．4 重组逆转录病毒载体pL-CD59TM的构建 重组质粒构建示意图如图4，用EcoR I从pGEM-
图 4重组质粒pL-MCP的构建
Fig 4Construction of CD59TM cDNA fragment into retroviral vector pLXSN
CD59TM质粒上切下574pb的CD59TM cDNA片段，克隆进入逆转录病毒载体pLXSN之中，以小量快速抽提质粒法选取重组质粒。为了确定插入片段的方向，用EcoR V酶切鉴定，如图5所示。选择出正向连接的重组克隆，命名为pL-CD59TM。
2.5 pL-CD59TM转染细胞及CD59TM分子表达鉴定 挑选用pLXSN和pL-CD59TM转染的PA317包装细胞克隆，收集病毒上清。利用包装后的病毒感染NIH3T3细胞，随机挑选G418抗性克隆8个，用anti-CD59单抗染色后，FACS检测其CD59的表达情况，结果显示8株克隆均有不同程度的表达，表达率为23％～42％。选取高表达克隆扩增传代，命名为3T3／CD59TM（见图6）。
3 讨论
CD59以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固于细胞膜外层，广泛分布于造血干细胞及其它多种组织细胞。它不含跨膜区，属于Ly-6家族成员［1］。CD59的主要
图 5重组质粒pL-MCP的酶切及其方向鉴定
Fig 5Electrophoresis for pL-CD59 on 1％ agarose gel
Line 1：λDNA／HindⅢ＋Eco RⅠ Markers；
Line 2：pL-CD59TM plasmid digested with EcoRⅠ
Line 3：pL-CD59TM plasmid digested with EcoR Ⅴ
Line 4：pL-CD59TM plasmid digested with EcoR Ⅴ
Line 5：λ DNA／HindⅢ Markers
图 6FACS测定重组3T3和EL-4细胞的CD59TM分子的表达
Fig 6Cell surface expression of human CD59TM on NIH 3T3 and EL-4 cells analysed by flow cytometry
功能是通过与同源补体C8、C9分子结合而阻止终末阶段膜攻击复合体（Membrane attack complex，MAC）的形成，防止补体活化造成对自身组织细胞的损伤［2，3］，这种自我保护机制对维持机体的正常生理功能具有重要的意义。现已明确：CD59的缺损或异常是导致夜间阵发性血红蛋白尿（PNH）的直接原因。PNH患者缺乏CD59分子存在两种机制：其一，由于CD59基因遗传性缺损所导致。日本的Ono和Yamashina等人报道了一例CD59纯合子遗传缺损所致的PNH病例，该例缺损是由于编码N-末端起始的第16位及第96位氨基酸的基因密码发生单基因缺失，引起阅读框移动，不能翻译成有完整功能的CD59分子所致［12，13］。这种情况可以通过导入编码完整的GPI型 CD59 cDNA进行基因治疗。其二，大多数的PNH是由于与X染色体连锁的基因GPI-A发生体细胞突变所致［4］。PIG-A基因编码的酶参与合成GPI糖脂链的初始阶段，即GlcNAC与PI的结合、以及此后的去酰基过程。GPI锚的合成障碍导致了细胞膜表面的CD59表达缺乏，使红细胞及其他组织细胞对自身补体的敏感性增加，引起PNH。在这种情况下，显然不能通过导入天然的GPI-锚固型的CD59基因来对PNH实行基因治疗，而导入并表达有功能的跨膜型CD59分子可为其基因治疗提供一条可尝试的途径。本研究基于这一设想，将编码人CD46分子跨膜区和膜内区cDNA片段和编码成熟的CD59胞外区蛋白的cDNA片段连接，构建了跨膜型的CD59分子cDNA；应用逆转录病毒载体pLXSN，成功地表达于小鼠NIH3T3和EL-4细胞，为进一步进行功能研究及应用提供了工具。
此外，CD59是一个多功能的分子，参与细胞粘附［1～2］、T细胞活化［5，6］等免疫反应过程。研究资料表明，用单抗交联T细胞表面的CD59分子，在与适量PMA或anti-CD3的共同作用下，能够引起T细胞活化和增殖。由于GPI-锚固型的CD59分子不含跨膜区和膜内区，其对细胞活化信号的转导方式一直是令研究者困扰的问题。一些研究表明，GPI锚固蛋白可与Src家族的p56lck或p59fry共沉淀，沉淀物中具有PTK活性［6，7］。有研究提示，GPI-锚固蛋白与PTK的联系可能依赖GPI锚的存在。为了更深入地研究GPI锚固蛋白的信号转导机制，本室在已经成功地克隆和表达GPI-锚固型CD59的基础上，又构建并表达了重组跨膜型CD59的细胞模型。这两种不同膜结合形式CD59细胞模型的建立，为进一步研究和阐明GPI锚在CD59介导的细胞活化信号转导中的作用和地位奠定了良好的基础。
国家自然科学基金委重点资助项目（项目号39630296）
第一作者：女，35岁，博士，副教授
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（1999-02-03收稿，1999-03-10修回）