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【摘要】 目的 探讨用放射的IL-12和B7-1转基因细胞进行癌疫苗疗法的效果及协同作用。方法 将逆转录病毒载体重组的小鼠IL-12、B7-1基因表达载体分别导入小鼠EL-4胸腺瘤细胞，利用转基因细胞治疗观察其抗肿瘤效果。结果 转基因细胞的肿瘤原性较EL-4/Wt、EL-4/Neo组明显降低（P<0.001）。同时免疫原性明显增强，以 60 Co照射的EL-4/IL-12、EL-4/B7-1细胞免疫后，小鼠体内诱发了抗EL-4/Wt的系统性、保护性免疫。用 60 Co灭活的转基因细胞作为瘤苗进行实验性治疗，能够延长小鼠的生存时间，减慢肿瘤的生长速度，EL-4/IL-12和EL-4/B7-1联合应用较单一的转基因细胞提高了治疗效果（P<0.01）。结论 放射的转基因细胞及其表达的IL-12细胞因子可以有效地激发机体的抗肿瘤免疫应答，IL-12与B7-1联合应用可以成为一种很有前景的癌疫苗。
关键词 IL-12 B7-1 癌疫苗 基因治疗
Study of cancer vaccine with irradiated IL-12
and B7-1transgenic cells
Wang Zhihua，Li Hong，Zhang Chunyan
Institute of Oncology，Harbin Medical University，Harbin150040.
【Abstract】 Objective To investigate the synergistically effect of irradiated IL-12and B7-1transfectant as cancer vaccine.Methods The retrovirus vector encoding mIL-12and mB7-1gene was transfected into EL-4thymic lymphoma cells respectively.The cells were used to treat the mice，the therapeutic effects were documented.Results In contrast to the mice with EL-4/Wt or EL-4/Neo groups，the tumorigenicity of EL-4/IL-12transˉfectant was decreased（P<0.001）.Immunization of mice with 60 Co irradiate EL-4/IL-12and EL-4/B7-1tumor cells showed significant systematic protective effects against the sequence rechallenge of EL-4/Wt.Vaccination with 60 Co irradiated EL-4/IL-12cells delays the occurrence of tumor and prolonged the survival period of tumor bearing mice.Combination of the vaccine ofEL-4/IL-12and EL-4/B7-1result in the enhanced therapeutic of each sinˉgle transfetants（P<0.01）.Conclusion The results showed that irradiated transgenic cells and IL-12could enˉhance the antitumor immunity of thehost.Combination of thevaccines of EL-4/IL-12and EL-4/B7-1improve immunity of host and is a prospect c
ancer vaccine in the near future.
Key words IL-12 B7-1 cancer vaccine gene therapy
在诱发抗肿瘤免疫反应中，细胞因子扮演了一个重要的角色 ［1～3］ ，很多基础及临床实验表明，投给细胞因子如IL-2、IL-4、IL-12可以刺激机体产生免疫反应。然而，全身投给细胞因子如IL-2、IL-12可以导致某些毒副作用的产生，因此很多研究者期望通过基因转导的方法将细胞因子转染肿瘤细胞，通过抗原调变和保持该细胞因子在局部缓慢释放的方式，提高疗效，避免全身副作用。根据这一原理，在以往的研究中我们尝试用活的转基因细胞用于实验动物肿瘤的治疗，取得了一定的疗效 ［4］ 。但出于将来临床治疗安全性的考虑，本研究我们旨在用射线处理的、亚致死量的IL-12、B7-1转基因细胞进行基因治疗的探索。
1材料与方法
1.1 主要试剂 DNA、RPMI1640、DMEM培养液、胎牛作血清和G418均购自Gibco公司。含小鼠IL-12、B7-1cDˉNA完整开放阅读框架的逆转录病毒载体TFG-mIL-12-Neo、TFG-mB7-1-Neo由日本东京大学医科大学研究所协作构建。
1.2 细胞株和实验动物 EL-4胸腺瘤细胞从美国ATCC获得，本室常规培养。C57BL/6小鼠购自中国医学科学院，雌性，6～8周龄。
1.3 方法
1.3.1 EL-4细胞转染与克隆 取对数生长期EL-4细胞1×10 6 /ml，分别加入转染了TFG-mIL-12-Neo、TFG-mB7-1-Neo的包装细胞培养上清，培养48h后，加G418（800μg/ml）继续培养，12d后，分别得到转IL-12和B7-1基因的EL-4细胞株。用流式细胞仪（FACS）检测IL-12，B7-1表达，有限稀释法对高表达的细胞进行克隆化。
1.3.2 细胞的放射处理 上述转基因细胞依实验要求用6 孔培养板培养，实验前8h用 60Co进行亚致死量照射（5000Rad），经检测，此时细胞的存活率>95%，具有正常表达及分泌能力。
1.3.3 小鼠抑瘤试验 分别取非照射的1×10 5 EL-4/Wt、EL-4/Neo、EL-4/IL-12、EL-4/B7-1细胞接种C57BL/6小鼠背部皮下，每隔2d观察并记录结节形成时间、生长速度及存活时间。每组10只，结节大小以长径×短径计算。
1.3.4 转基因细胞的免疫保护试验 小鼠随机分组分别注射经 60 Co照射的EL-4/Wt、EL-4/Neo、EL-4/IL-12、EL-4/B7-1细胞5×10 6 。15d后皮下接种非照射的EL-4/Wt细胞，观察肿瘤结节的生长情况及小鼠的存活时间。
1.3.5 转基因细胞的试验性治疗 以非照射的EL-4/Wt细胞1×10 5 皮下接种C57BL/6小鼠，接种后第3、6、9天以 60 Co照射的2.5×10 5 EL-4/Wt细胞分别和2.5×10 5 各种转基因细胞1∶1混合，再接种对侧皮下，观察肿瘤结节的生长情况及小鼠的存活期。
2 结果
2.1 转基因细胞株的建立 对转染后的EL-4细胞进行FACS分析显示，EL-4/Wt、EL-4/Neo、EL-4/IL-12细胞表面MHCⅠ、Ⅱ类分子表达差异无显著性。EL-4/B7-1细胞诱导了CD80的高效表达。通过有限稀释及ELISA方法对高表达细胞株进行了克隆和筛选，第32株转EL-4/IL-12细胞IL-12的分泌量为30.75ng/10 6 /24h。
2.2 转基因细胞的肿瘤原性 非照射的转基因细胞EL-4/IL-12、EL-4/B7-1与EL-4/Wt、EL-4/Neo细胞在小鼠体内的生长状况及存活期明显不同，EL-4/Wt、EL-4/Neo肿瘤细胞接种小鼠皮下，肿瘤结节的检出时间、生长速度及存活期差异无显著性。而EL-4/IL-12和EL-4/B7-1细胞组肿瘤的形成时间明显推迟，生长速度明显减慢，存活期也显著延长，见图1。
Fig1 略
2.3 转基因细胞的免疫保护作用 用 60 Co照射处理的EL-4/Wt、EL-4/Neo、EL-4/IL-12和EL-4/B7-1肿瘤细胞作为瘤苗分别免疫C57BL/6小鼠，15d后接种非照射的EL-4/Wt肿瘤细胞，观察免疫保护作用。结果表明 60 Co灭活的EL-4/Wt和EL-4/Neo细胞未能诱导有效的保护性免疫。在12d左右可检出肿瘤结节，存活期约32d。而经EL-4/IL-12细胞免疫后的小鼠肿瘤生长明显抑制，观察期结合仍有2只小鼠未检出结节，生存时间显著延长（P<0.001）。经EL-4/B7-1细胞免疫的小鼠治疗效果同EL-4/IL-12组类似。以上结果提示转基因细胞的免疫原性显著增强，并能诱导机体产生有效的抗肿瘤效应，见表1。
2.4 转基因细胞的试验性免疫治疗 用非照射的EL-4/Wt肿瘤细胞预先接种C57BL/6小鼠，在3、6、9d分别用 60 Co照射的各种混合细胞接种小鼠观察肿瘤生长情况。发现此 治疗可明显推迟肿瘤结节检出时间，延缓肿瘤的生长速度，并有效地延长了荷瘤宿主的存活时间，见表2。
2.5 EL-4/IL-12和EL-4/B7-1协同抗肿瘤作用 在治疗实验中，同时接种了EL-4/IL-12和EL-4/B7-1转基因细胞的小鼠肿瘤生长较单一治疗明显减慢（P<0.01），提示二者结合具有协同抗肿瘤免疫作用，见表2。
Table1 Antitumor immunity induced by EL-4/IL-12 and EIL-4/B7-1protective against the challenge with wild type EL-4cells略
Table2 Therapeutic effect on EL-4/Wt tumor with irradiated transfectants （略）
3 讨论
大量的研究表明，将某些细胞因子基因转入肿瘤细胞制成新型的肿瘤疫苗，可以有效的激发机体有效的抗肿瘤免疫功能，此种方法已成为肿瘤基因治疗的研究热点和较好的手段。IL-12由于具有强大的抗肿瘤作用和多种生物学活性而受到重视，研究发现IL-12对实体肿瘤和转移癌都有确切的治疗效果，在许多肿瘤模型中证实IL-12与IL-2和IFN-γ相比抗肿瘤效果更好、更强，且副作用较低。研究提示应用IL-12可明显抑制肾细胞癌、黑色素瘤B16F10、网织细胞肉瘤M5076在小鼠模型中的生长，局部注射至瘤体周围也可使动物的皮下肿瘤减小或消失 ［5，6］ ;腹腔投给可抑制肿物的生长及腹水的减少和消退;最近有研究者采用小量、多次的投药方式（每周100ng，总共16次）证明可通过抑制HER-2/neu基因而抑制乳腺肿瘤的生长 ［7］ 。本实验中将IL-12基因导入肿瘤细胞证明转基因细胞肿瘤原性降低、免疫原性增强，获得了较好的治疗效果。
IL-12联合其它细胞因子作用于免疫反应的相同环节或不