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【摘要】 目的 探讨HLA-DRB1、DQB1位点基因与银屑病的相关性，探讨HLA-DRB1、DQB1位点基因在山东籍汉族银屑病易感性中的作用。方法 用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法， 对36例泛发性脓疱型银屑病患者进行了HLA-DRB1、DQB1等位基因的分型， 并分析了上述基因在各组中的分布。结果 泛发性脓疱型银屑病患者组DR7、DQB1*0201、DQB1*0603频率较正常对照组显著增高。结论 寻常型银屑病、关节病型银屑病与泛发性脓疱型银屑病在发病机制方面存在共同的遗传易感基因，而后两者又有其特殊的遗传背景。
【关键词】 银屑病；寻常型；关节病型；脓疱型； HLA-DRB1； HLADQB1
Study on the association between HLA-DRB1, DQB1 genes in patients with psoriasis in Han Shandong Chinaes
ZHOU Shuhua WANG Xiuming HAN Zhaodong et al
Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To investigate the correlation of HLA-DRB1,DQB1 genes in psoriasis in Han Shandong Chinese.Methods Polymerase chain reaction-specific sequence primers ( PCR-SSP) method was used to type HLA-DRB1, DQB1 subregion in 36 cases with generalized pustular psoriasis and matched control subjects of Han nationality from Shandong Province.Results The results demonstrated that the frequency of HLA- DR7, DQB1*0201 , DQB1*0603 allele frequency in patients with generalized pustular psoriasis were significantly higher than those in controls. Conclusion The above mentioned two types of psoriasis have similarity in the association between disease and HLA class II genes susceptibility.There were differences among in HLA disease association.
【Key words】 psoriasis, pustular,generalized,HLA-DRB1,HLA-DQB1
泛发性脓疱型银屑病是银屑病的一种类型。1998年日本学者Ozawa 等［1］对泛发性脓疱型银屑病与HLA抗原/基因相关性进行了研究，发现泛发性脓疱型银屑病的易感性与HLA-Cw1以及 HLA DQB1*0303明显相关，表明与泛发性脓疱型银屑病关联的HLA等位基因不同于寻常型银屑病。本研究的目的在于分析与研究山东籍汉族泛发性脓疱型银屑病与HLA-II类基因的相关状况，探讨本病的病因、发病机制。
1 资料与方法
1.1 研究对象 山东籍汉族泛发性脓疱型银屑病患者36例，其中男21例，女15例，年龄9～65岁。先前有寻常型银屑病病史并在寻常型银屑病基础上发病者19例，先前无寻常型银屑病病史者17例，在脓疱消失后均有过典型寻常型银屑病皮损。正常对照组为与患者同地区的，与患者无血缘关系的健康人群，共70例，年龄13～75岁，其中男35例，女22例。患者组与对照组年龄、性别比较无显著差异（P＞0.05）。
1．2 实验方法
1．2．1 基因组DNA的制备：分离静脉血白细胞，用饱和盐洗法提取基因组DNA。将DNA溶解于0.3～0.4 ml 的TE缓冲液中。取2 μl DNA样品，用紫外分光光度法检测样品的A值及双链DNA浓度，最后DNA均调整至100 μg /ml。
1．2．2 系列标准DNA：由上海第二医科大学免疫室范丽安教授馈赠。
1．2．3 PCR-SSP方法检测 HLA-DRB1、DQB1位点的基因型：特异性引物及阳性对照引物由中国医学科学院细胞生物研究所上海赛尔公司合成，引物浓度为50 pmol/μl。DRB1引物:13个上游引物，15个下游引物组成19对不同的引物对［１］；DQB1引物：7个上游引物，10个下游引物组成13对不同的引物对［２］。
PCR反应：50 μl反应体系中含有基因组DNA 60 ng，浓度为50 pmol/μl 的上游引物和下游引物各2.5 μl，阳性对照引物用量为特异性引物的1/5，10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 5 μl，Taq-DNA聚合酶（Promega）1.5 u。扩增在DNA热循环扩增仪（Perkin Elmer）上进行，共35个循环，扩增条件参考文献［1,2］。
1．2．4 基因型的确定：2%的琼脂糖凝胶电泳，100 V稳压30 min。紫外灯下观察，根据PCR产物的有无及大小确定基因型别。
1．3 统计学分析 用直接计数法计算基因频率，两组间基因频率的比较采用χ2检验。P值均用Bonferron法进行校正得校正P值（Pc），即P值乘以实验系统所检出的基因数，显著性检验水平为0.05。用比值比(OR)代表疾病与HLA基因的相关性强度。
2 结果
2．1 基因组DNA抽提效果的检测 饱和盐洗法所提取的基因组DNA纯度及浓度，使用饱和盐洗法提取白细胞基因组DNA，用紫外分光光度仪(Pharmacia)自动测出所提DNA的纯度——A值(OD260/280)、双链DNA的浓度及标本中的蛋白质浓度。将所提取标本作50倍稀释后测得的DNA的纯度为1.621～1.853，双链DNA的浓度为161.19～388.61，标本中的蛋白质含量为0.1～0.4 mg/ml，均能满足本实验要求。
2．2 HLA-DRB1以及HLA-DQB1亚区的DNA分型结果
2．2．1 DNA扩增效果的检测：经饱和盐洗法所提取的基因组DNA样本经PCR扩增后，阳性者在1.8%的琼脂糖电泳凝胶上可见一清晰条带，分子量与预期值一致，与标准DNA的扩增产物完全相同。
2．2．2 泛发性脓疱型银屑病患者和正常对照组HLA-DR基因频率的分布：结果见表1。表1 泛发性脓疱型银屑病患者和对照组 HLA-DR基因频率的分布注：△为Fisher精确概率法计算的P值，DR7的Pc值分别为0.042546
与正常对照组相比，患者组HLA-DR7频率显著增高（χ2=13.05，P=0.0003，DR=4.50）；HLA-DR10的频率虽然也增高，但校正后无统计学意义。与正常对照组相比，原有寻常型银屑病病史的19例患者HLA-DR7、DR10频率显著增高；HLA-12的频率显著降低。
2．2．3 泛发性脓疱型银屑病患者和正常对照组HLA-DQB1基因频率的分布：结果见表2。表2 泛发性脓疱型银屑病患者和对照组 HLA-DQB1基因频率的分布注：Fisher精确概率法计算的P值矫正后DQB1*0201、DQB1*0603的Pc值分别为0.0156156和0.025974
与正常对照组相比，患者组HLA-DQB1*0201频率显著增高（χ2=10.49，P=0.0012，OR=3.0）； DQB1*0603频率虽然增高，但校正后无统计学意义。与正常对照组相比，原有寻常型银屑病病史的19例患者HLA-DQB1*0201、DQB1*0603频率显著增高。
原无寻常型银屑病病史的17例患者各等位基因频率较对照组无显著性差别。
3 讨论
泛发性脓疱型银屑病是银屑病的一种类型，本组患者可有寻常型银屑病病史，而部分没有寻常型银屑病病史。1998年日本学者Ozawa等［1］对泛发性脓疱型银屑病与HLA抗原/基因相关性进行了研究，发现泛发性脓疱型银屑病的易感性与HLA-Cw1以及 HLA DQB1*0303明显相关，表明与泛发性脓疱型银屑病关联的HLA等位基因不同于寻常型银屑病。另一位日本学者将泛发性脓疱型银屑病分为原有寻常型银屑病病史和原无寻常型银屑病病史两种类型，前者发病年龄较晚，触发因素多为糖皮质激素治疗或不规则减量；后者发病年龄较早，常因上呼吸道感染诱发［4］。
我们的研究结果显示HLA- DRB1*07及HLA-DQB1*0201等位基因频率在山东籍汉族泛发性脓疱型银屑病患者中显著高于健康对照组，即泛发性脓疱型银屑病与HLA- DRB1*07及HLA-DQB1*0201、DQB1*0603等位基因呈正相关，表明与泛发性脓疱型银屑病相关联的HLA等位基因不同于寻常型银屑病。对原有寻常型银屑病病史和原无寻常型银屑病病史两种类型进行分层研究，结果显示在原有寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病患者中HLA-DRB1*07及HLA-DQB1*0201、DQB1*0603等位基因频率显著高于对照组；而在原无寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病患者中DQB1*0602频率显著高于对照组；表明HLA-DRB1*07及HLA-DQB1*0201、DQB1*0603与原有寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病相关联，DQB1*0602与原无寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病相关联，此结果与国内研究结果［5，6］一致，均支持原有寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病与原无寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病具有遗传异质性的观点。
【参考文献】
［1］ Ozawa A, Miyahara M, Sugai J, et al. HLA class I and II alleles and susceptibility to generalized pustular psoriasis: significant associations with HLA-Cw1 and HLA-DQB1*0303［J］. J Dermatol, 1998, 25: 573-581.
［2］ 周淑华，林麟，靳培英，等.江苏、安徽汉族天疱疮患者HLA-DR基因的相关性研究［Ｊ］.中华皮肤科杂志,2002,35（1）:13-16.
［3］ 周淑华，林麟，靳培英,等. HLA-DRB1、DQB1基因与汉族人寻常型天疱疮的相关性研究［Ｊ］. 中华医学遗传学杂志,2003,20（1）：79-81.
［4］ Ohkawara A, Yasuda H, Kobayashi H,et al. Generalized pustular psoriasis in Japan: two distinct groups formed by differences in symptoms and genetic background［Ｊ］. Acta Derm Venereol, 1996, 76: 68-71.
［5］ 付洪军，张福仁. 泛发性脓疱型银屑病与HLA-DQB1等位基因的相关性研究［J］. 中华皮肤科杂志，2005，38（3）：137-139.
［６］ 周淑华，王秀敏，韩兆东，等.山东籍汉族寻常型天疱疮与HLA-DRB1基因的相关性研究［Ｊ］.滨州医学院学报，2006,29(6):401-402.
作者单位：1 滨州医学院附属医院皮肤科 滨州市 256603；2 山东省立医院皮肤科