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【关键词】 红细胞系特异性启动子; 荧光蛋白; 基因表达
Expression of fluorescence protein in K562 cells driven by erythroid-specific promoter
XIE Shuyang WANG Pingyu YAO Baohong et al
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Binzhou Medical University, Binzhou 256603
【Abstract】 Objective Studing the effect of erythroid-specific promoter can effectively drive expression of green/red fluorescence protein(GFP/RFP) in K562 cells. Methods Erythroid-specific promoter(β globin promoter) was amplified by PCR from human genome DNA, which was cloned into pcDNA vector to drive GFP/RFP gene expression. Then the vectors were transfected into K562 cells to prove the effect of the promoter by using fluorescence microscopy and RT-PCR.Results Fluorescence microscopy showed that GFP/RFP can strongly express in K562 cells. And the mRNA was also shown to express effectively by RT-PCR analysis.Conclusion The erythroid-specific promoter can obviously drive gene expression in K562 cells, which is valuable for gene therapy to leukemia as well as other hematology diseases.
【Key words】 erythroid-specific promoter,fluorescence protein,gene expression
人类珠蛋白基因是一种研究人类基因组结构与功能相关性的理想材料。珠蛋白基因的表达，具有发育阶段特异性和珠蛋白表达的组织特异性［1］。而启动子在保证珠蛋白各功能基因组织及发育阶段特异性表达方面起重要作用［2］。因此克隆β-珠蛋白启动子对血液病的治疗和基因表达调控研究具有重要价值。本实验旨在克隆β-珠蛋白启动子，用其驱动目的基因在造血细胞系中表达，验证启动子的有效性，为血液病基因治疗作基础准备。
1 材料与方法
1.1 材料 脂质体2000购自Invitrogen 公司，RNA 提取试剂盒购自U-GENE公司，MluI、NheI、SpeI等酶、逆转录酶购自TaKaRa公司，K562细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司，GFP和RFP载体由山东大学崔行教授惠赠。
1.2 启动子的扩增 从人的基因组DNA中扩增β珠蛋白启动子，引物序列正向：5′-ATTCAAACTTCCGCAGAACACT-3′，反向：5′-GGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCA-3′；PCR反应条件为：94℃ 3 min，1个循环； 94℃ 30 s，58℃ 45 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min，1个循环。将扩增片段（2.1 kB）克隆到T载体上，得到T-Pro载体，并测序证明干扰片段序列正确。
1.3 载体构建 利用MluI（酶切后补平）和NheI酶切pcDNA3.1(-)载体，用SphI （酶切后补平）和SpeI酶切T-Pro载体，将启动子克隆至pcDNA3.1(-)载体上构建p-Pro载体。然后，利用EcoRI 和AflII酶切位点，将GFP 从PEGFP-N载体克隆至p-Pro载体上，构建p-Pro-GFP载体(用β-珠蛋白启动子启动GFP表达)。利用XbaI和BamHI酶切位点，将RFP从pDsRed载体克隆至p-Pro载体上，构建p-Pro-RFP载体(用β-珠蛋白启动子启动RFP表达)，在体结构见图1。
Pro:人β珠蛋白启动子； GFP/RFP： 绿色荧光或红色荧光蛋白基因； PolyA：多聚腺嘌呤核苷酸
图1 GFP/RFP表达载体结构图
1.4 细胞培养及转染 K562细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养。然后，将1 μg p-Pro-GFP载体（或p-Pro-RFP载体），采用脂质体方法转染到K562细胞中，细胞转染方法按厂家说明进行。
1.5 细胞GFP/RFP检测与分析
1.5.1 荧光显微镜观察［3］：细胞转染72 h后，PBS洗一次，用细胞计数板将各实验组细胞浓度调至一致，用荧光显微镜（Leica，DMRXA2）观测荧光。
1.5.2 RT-PCR分析GFP/RFP在细胞中表达情况：提取K562细胞总RNA，进行逆转录反应，然后通过PCR扩增GFP基因。GFP扩增引物为5′-CACATGAAGCAGCACGACTTCT-3′和5′-AACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3′；PCR条件为：94℃变性 4 min，然后94℃ 1 min, 55℃ 45 s, 72℃ 1 min, 共30个循环，最后72℃ 延伸10 min。RFP扩增引物为5′-CGAGGGCTTCAAGTGGGA-3′和5′-TCAGGAACAGGTGGTGGC-3′；PCR条件为：94℃变性 3 min，然后94℃ 1 min, 58℃ 45 s, 72℃ 1 min, 共31个循环，最后72℃ 延伸10 min。β-actin作为参照物：上游: 5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′, 下游: 5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′，PCR条件同GFP。PCR产物用2%的凝胶进行电泳分析。
2 结果
2.1 荧光显微镜直接观察GFP/RFP的表达 K562细胞转染p-Pro-GFP或p-Pro-RFP载体，荧光显微镜观察发现，在β珠蛋白启动子作用下，GFP和RFP均能有效的表达（图2），但是GFP和RFP表达量不是很一致，原因可能与纯化载体的纯度有关系。
左图表示转染p-Pro-GFP载体后，GFP表达检测；右图为转染p-Pro-RFP载体，RFP表达检测
图2 K562细胞荧光表达情况（200×）
A. GFP(470 bp) cDNA表达检测；B. RFP(410 bp)cDNA表达检测；C. 内参β-actin(260 bp)检测
1，2：转染p-Pro-GFP/p-Pro-RFP实验组; 3：阴性对照组；M:100 bp marker
图3 RT-PCR分析GFP或RFP mRNA表达
2.2 RT-PCR检测GFP或RFP mRNA在细胞中表达 提取实验各组细胞的RNA，进行逆转录PCR反应，结果如图3示，GFP、RFP mRNA在K562细胞中表达较高，表明所克隆的β珠蛋白启动子是有效的。
3 讨论
地中海贫血是由于珠蛋白肽链合成速率的降低，导致α链与非α链合成的不平衡，在临床上表现为溶血性贫血。其分子基础是由于珠蛋白基因的突变造成的［4］，对于其治疗方向主要有基因治疗与药物治疗。药物治疗就是应用某些药物激活非α链珠蛋白基因的表达，达到治疗的目的。研究发现，羟基脲HU在培养的红系细胞及动物模型中均能促进β-珠蛋白及γ-珠蛋白的合成，是一种有希望治疗β地中海贫血的药物［5］。基因治疗是选择合适的表达载体，将人类珠蛋白基因装在HSs元件及珠蛋白基因顺式元件（启动子）下游，使其能随个体发育而进行组织及发育阶段特异性表达，从而达到治疗目的。
人类珠蛋白功能基因的启动子主要有3类保守序列，在-30 bp处有TATA盒，-70 bp处有CCAAT元件，另外一个为CACCC元件，其中β-珠蛋白基因-90、-105 bp处分别有一个CACCC元件。β珠蛋白基因启动子TATA盒的缺失或突变，可（地贫）导致β-珠蛋白基因表达量下降，出现β-地中海贫血症状［6］。研究发现-90 bpCACCC盒自发性突变所导致的地贫，要比-105 bpCACCC元件突变所致地贫严重得多［7］。在转基因实验中，β-珠蛋白基因的高表达至少需要长1555 bp的启动子，这是因为在远侧启动子，还有许多公共转录因子的结合位点，它们通过蛋白间或蛋白与DNA之间相互作用，调控β-珠蛋白基因的表达［8］。
此实验中我们克隆了长约2.1 kB的β-珠蛋白启动子进行研究，该启动子包含了3类保守序列：TATA盒、CCAAT元件和CACCC元件。克隆β-珠蛋白启动子之后，我们构建载体，用β-珠蛋白启动子驱动报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)表达；然后，转染人K562细胞验证启动子的有效性。结果表明克隆的β-珠蛋白启动子能有效的驱动目的基因在白血病细胞系中表达，为下一步应用该启动子进行红细胞系基因表达调控和基因治疗研究奠定基础。
【参考文献】
［1］ Dos Santos CO, Costa FF.AHSP and beta-thalassemia: a possible genetic modifier［J］. Hematology，2005,10(2):157.
［2］ Sabatino DE, Cline AP, Gallagher PG,et al. Substitution of the human beta-spectrin promoter for the human gamma-globin promoter prevents silencing of a linked human beta-globin gene in transgenic mice［J］. Mol Cell Biol，1998，18(11):6634.
［3］ 谢书阳，王萍玉，岳真，等.应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果［J］.滨州医学院学报，2007，30（4）：241-243.
［4］ 曾溢滔. 人类血红蛋白［Ｍ］. 上海：科学出版社，2002：118.
［5］ Zeng YT, Huang SZ, Ren ZR, et al. Hydroxyurea therapy in β-thalassemia intermedia: improvement in haematological parameters due to enhanced β-globin synthesis［J］. Br J Haematol， 1995, 90:557.
［6］ Berg PE, Schechter AN. The impact of molecular biology on the diagnosis and treatment of hemoglobin disorders［Ｊ］. Mol Genet Med，1993, 2:1.
［7］ Feng WC, Southwood CM, Bieker JJ.Analysis of β-thalassemia mutant DNA interactions with the erythroid Kruppel-like factor(EKLF), an erythroid cell-specific transcription factor［J］.J Biochem，1994, 269:1493.
［8］ Pasceri P, Pannell D, Wu Xin,et al. Full activity from human β-globin locus control region transgene requires 5’HS1, distal β-globin promoter, and 3’ β-globin sequences［J］.Blood，1998,92(2):653.
作者单位：1 滨州医学院生物化学与分子生物学教研室 滨州市 256603；2 滨州医学院卫生学教研室；